乔志刚,刘淑琰,沈方方

(河南师范大学水产学院,河南新乡453007)

鲇精子超微结构及pH、温度对其精子活力的影响

乔志刚,刘淑琰,沈方方

(河南师范大学水产学院,河南新乡453007)

为了解鲇Silurus asotus精子的结构特征,应用扫描电镜和透射电镜技术,对体质量为320～550 g的鲇成熟精子结构进行了观察。结果表明:鲇精子由头和尾两部分组成,无明显颈部;精子头部近球形,直径为1.85～2.51μm,头部无顶体,头部内有高度密集的细胞核染色质,头部后方凹陷形成植入窝,植入窝内有近端中心粒和远端中心粒,细胞核后方与质膜的间隙较大(称袖套),其内富含细胞质、线粒体和囊泡等细胞器;尾部细长,无主段和尾段之分,长为44.3～50.7μm,横切面呈圆形,直径为0.269～0.308μm,透过横断面可见,鲇精子尾部由轴丝和附属纤维构成,外有一层质膜包裹,轴丝与远端中心粒形成“9+2”微管结构。研究表明,精子活力的适宜pH为7.0～8.5,适宜温度为25～29℃,当pH为8.0、温度为28℃时,精子活力最强。

鲇;精子;超微结构;精子活力

鲇Silurus asotus隶属于鲇形目Siluriformes、鲇科Siluridae、鲇属Silurus,是中国重要的土著经济鱼类之一,广泛分布于珠江、长江、黄河、黑龙江等水系[1]。随着中国水产养殖结构的调整,鲇在池塘及其他水域中的养殖不断增多,人们对鲇的关注力也不断增强,相关研究涉及鲇的繁殖生物学、生理生态和人工增养殖技术等多项内容[1-2]。

对动物精子超微结构的研究,便于人们深入认识精子的结构特征及精子结构在受精过程中变化的生理意义。中国学者曾对鲇形目鱼类革胡子鲶Clarias lareza[3]、南方大口鲇Silurus meridionalisChen[4]等鱼类精子的超微结构进行过相关研究,但有关鲇成熟精子超微结构及其活力的研究尚未见报道。本研究中以鲇成熟精子为对象,应用扫描电镜和透射电镜技术,对鲇成熟精子结构进行了观察,同时,对不同pH和温度下的鲇精子活力进行了研究,旨在了解鲇精子的结构特征,并为鲇受精生物学和鲇苗种人工繁育的规模化积累基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼由河南省黄河鲇良种繁育基地提供。选择体长为31.2～37.5 cm、体质量为320～550 g的健康、成熟雄性鲇10尾用于试验。

1.2 方法

1.2.1 精子的采集 采用绒毛促性腺激素(HCG)与促黄体素释放激素类似物(LRH-A)的混合溶液,对成熟鲇雄鱼进行人工催产,催产剂量为每千克体质量的雄性鲇亲鱼注射HCG 500IU+ LRH-A 5μg,胸腔注射。将注射后的鲇亲鱼放入水深为50～80 cm、进排水方便、面积为2～4 m2的水池中等待成熟。

在水温为22～26℃条件下,10 h(效应时间)后捞取亲鱼,一人一手用湿毛巾固定亲鱼头部,使其腹部向上,另一手准备用吸管吸取鲇精液;同时,另一人用干毛巾迅速擦干亲鱼体表的水分,一手稳住亲鱼尾部,轻轻挤压其腹部,见精液流出时,用吸管迅速吸取。

1.2.2 扫描电镜标本的制备 用吸管吸取适量鲇精液置于1.5 mL离心管中,用等量生理盐水(0.9％)稀释,加入2.5％戊二醛固定2～4 h,将固定后的鲇精液滴加在叔丁醇制作的薄膜上,室温下干燥5 min,用梯度浓度酒精脱水,在电压为150 V、镀金膜为3 min条件下,使用日立SU 8010扫描电镜观察并拍照。

1.2.3 透射电镜标本的制备 用吸管吸取适量鲇精液置于1.5 mL离心管中,用等量生理盐水进行稀释,加入2.5％戊二醛固定2～4 h,以0.1 moL磷酸缓冲液(pH 7.4)冲洗3次后,加入1％锇酸固定2 h,用梯度浓度酒精脱水,用丙酮与纯812树脂(体积比为1∶1)对样品渗透过夜,再用纯812树脂包埋、徕卡(Leica U7)超薄切片机切片(60～80 nm),以醋酸铀和柠檬酸双染色,室温下干燥后,在JEM-2100F型透射电镜下观察并拍照。

1.2.4 精子活力观察 精子活力主要从精子快速运动时间和存活时间两方面判定[4-5]。其中,精子的快速运动时间是指精子自激活后到90％精子原地颤动的时长;精子的存活时间是指精子自激活后到90％精子停止原地颤动的时长[5]。

用0.1 mol/L的盐酸溶液或0.1 mol/L氢氧化钠溶液与纯水分别配制pH为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的水溶液,并置于水温为26℃的水浴锅中备用;取一载玻片,以针头挑取少量精液置于载玻片上,与配制好的水溶液等量混匀,在显微镜下观察精子活动状态,并记录精子的快速运动时间和存活时间。每个pH值溶液状态下进行5次取样观察、记录,取其平均值。

用0.1 mol/L氢氧化钠溶液与纯水配制pH为8.0的水溶液,分装于8支洁净的试管内,分别置于温度为19、22、25、28、31、34、37℃的水浴锅或恒温箱中备用;取一载玻片,以针头挑取少量精液置于载玻片上,并与预热好的水溶液等量混匀,在显微镜下观察精子活动状态,记录精子的快速运动时间和存活时间。每个温度状态下进行5次取样观察、记录,取其平均值。

2 结果与分析

2.1 鲇精子结构

2.1.1 扫描电镜下鲇精子整体结构观察 扫描电镜下观察,鲇精子属鞭毛型精子,其主要由头和尾两部分组成,无明显的颈部且无顶体。精子全长为45.5～52.2μm;头部近球形,直径为1.85～2.51 μm;尾部细长,为44.3～50.7μm,尾部外无侧鳍(图1-A)。

2.1.2 透射电镜下鲇精子头部结构观察 透射电镜下观察,鲇精子头部外周有质膜包裹,前端不存在顶体或与顶体类似的膜(图1-B～D)。精子头部的主要结构是细胞核,细胞核染色质密集,但存在较小空隙,这些小空隙称为核空隙,核空隙的位置和形状不确定(图1-C、D)。细胞核前半部分与质膜的间隙很小,细胞质含量相对较少,无线粒体和囊泡等细胞器。头部后方有一较浅凹陷部分,为植入窝(图1-B),内有中心粒复合体;中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒(也称远基体)两部分组成,近端中心粒长轴与远端中心粒长轴垂直,即呈“T”型(图1-C、F)。

细胞核后半部分与质膜的间隙较大,呈筒状,为袖套;袖套中含有丰富的细胞质、线粒体和囊泡等细胞器。袖套纵切面上可见2～3个线粒体,横切面上可见4～5个线粒体(图1-C～E)。线粒体在精子头部的分布不规律,切面上呈圆形或椭圆形,由双层膜构成,内外膜有间隙,内膜向内延伸成嵴(图1-E)。袖套与尾部的轴丝形成的空腔为袖套腔(图1-B)。

2.1.3 透射电镜下鲇精子尾部结构观察 透射电镜下观察,精子尾部起源于袖套腔(图1-B),其横切面呈圆形(图1-H),直径为0.269～0.308 μm。尾部纵切面无主段和尾段之分,其基本结构一致,主要由轴丝、附属纤维组成(图1-G、H),其中轴丝与远端中心粒形成典型的“9+2”微管结构,即微管由2条中央纤维和9组外周纤维组成(图1-H)。

2.2 鲇精子活力

2.2.1 pH对精子活力的影响 鲇精子在不同pH水体中的快速运动时间和存活时间见表1。在水温为26℃条件下,鲇精子在不同pH水体中的活力不同,即随着水体pH的逐渐升高,鲇精子的快速运动时间和存活时间逐渐延长;当水体pH由酸性(pH 6.0)升高至弱碱性时,鲇精子的快速运动时间(44.8 s,pH 7.5时)和存活时间(107.4 s, pH 8.0时)达到最长;当水体pH达到8.5时,鲇精子活力开始下降;当水体pH大于9.0时,精子的快速运动明显减弱。

2.2.2 温度对精子活力的影响 鲇精子在不同水温下的快速运动时间和存活时间见表2。在水体pH为8.0条件下,鲇精子在不同水温下的活力不同,即随着水温的逐渐升高,鲇精子的快速运动时间逐渐延长,而精子存活时间则逐渐缩短;当水温升至28℃时,鲇精子的快速运动时间达到最长(42.8 s);当水温升至34℃时,鲇精子的快速运动时间下降,精子存活时间迅速缩短;当水温升至37℃时,鲇精子失活。

注:A为扫描电镜下精子整体结构;B为透射电镜下精子整体纵切;C为透射电镜下精子头部纵切;D为透射电镜下精子头部纵切;E为透射电镜下精子尾部横切;F为透射电镜下精子头部纵切;G为透射电镜下精子尾部的远核端纵切;H为透射电镜下精子尾部的近核端横切,轴丝“9+2”结构。HE示头部;FL示尾部;IF示植入窝;S示袖套腔;N示细胞核;NG示核空隙;PC示近端中心粒;DC示远端中心粒;M示线粒体;V示囊泡;AX示轴丝;CF示中央纤维;PF示外周纤维Note:A,scanning electron microscopy of sperm;B,longitudinal section of sperm in transmission electron microscopy(TEM);C,longitudinal section of sperm head in TEM,showing structure of the head;D,longitudinal section of sperm head in TEM;E,cross section of sperm flagellum in TEM;F,longitudinal section of sperm head in TEM,showing the connection between the proximal centriolesand the distal centrioles;G,longitudinal section of sperm flagellum in TEM;H,cross section of sperm flagellum in TEM,showing the“9+2”model.HE,head;FL,flagellum;IF, implantation fossa;S,central space in the sleeve;N,nucleus;NG,gap within nucleus;PC,proximal centriole;DC,distal centriole;M,mitochondrion;V,vesicle;AX,axoneme;CF,central fibril;PF,peripheral fibril图1 鲇精子超微结构Fig.1 Ultrastructure of spermatozoon in oriental sheatfishSilurus asotus

表1 不同pH条件下鲇精子活力状况Tab.1 Sperm motility of oriental sheatfishSilurus asotusin different pH values

表2 不同温度条件下鲇精子活力状况Tab.2 Sperm motility of oriental sheatfishSilurus asotusin different temperature

3 讨论

3.1 鲇精子结构划分

硬骨鱼精子大部分由头部、颈部和尾部3部分组成[6],头部主要结构是细胞核,尾部主要结构是轴丝和附属纤维,颈部是连接头部和尾部的部分,包括线粒体、中心粒复合体、囊泡等细胞器。而虾虎鱼类[7]、草鱼Ctenopharyngodon idellus[3]、革胡子鲶Clarias lareza[3]等一些硬骨鱼类精子的颈部不明显,中心粒复合体、线粒体等细胞器出现在细胞核后端凹陷形成的植入窝中,观察发现,鲇精子属鞭毛型精子,精子由头部和尾部组成,无颈部。头部近球形,尾部细长呈圆柱形。精子全长为45.5～52.2μm,其中头长为1.85～2.51μm,尾长为44.3～50.7μm,尾长是头长的18～27倍;尾部横切面直径为0.269～0.308μm,头部直径为尾部横切面直径的148～194倍。

3.2 精子顶体与卵膜结构

顶体是动物精子头部顶端由高尔基体发育而来的特化小泡,实质是一种溶酶体。刘筠等[6]认为,硬骨鱼类的精子分为顶体型精子和无顶体型精子。本研究中观察发现,鲇精子头部前端只有一层质膜,未见顶体和类似顶体的结构,可认为鲇精子无顶体存在。

Poirier等[8]和丁淑荃等[9]认为,某些硬骨鱼类的精子不具备顶体,可能是其成熟卵子的质膜外存在一个或多个卵膜孔所致;周海燕等[10]和Shahin[11]认为,一些鱼类顶体的缺乏,应该是一种物种适应性退化。本研究中观察发现,鲇精子头部前端只有一层质膜,未见顶体和类似顶体的结构。牛景彦[12]前期研究发现,鲇成熟卵子上具有卵膜孔存在。魏刚等[13]研究发现,鲇精子在受精过程中其头部可以直接通过卵膜孔进入卵子。可见,鲇精子头部不具备顶体结构是与鲇成熟卵子特定质膜结构相适应的一种表现。

3.3 精子头部细胞器的变化

硬骨鱼类精子头部的主要结构是染色质高度致密的细胞核,细胞核中常见有少量、不均等分布的空隙,称核空隙。林光华等[3]、魏钢等[14]认为,这种结构是核泡;而尤永隆等[15]认为,这些只是染色质在高度浓缩下的空隙,并非单层膜组成的核泡。本研究中观察发现,鲇精子头部细胞核中存在形状不规则、无膜包裹的空隙结构,认为该结构应该是染色质密集中的空隙,并非核泡。另外,鲇精子的核前端与质膜的间隙很小,不像斜带石斑鱼Epinephelus coioides[5]精子和金鱼Carassius auratus[16]精子的核前端与质膜间存在丰富的细胞质、线粒体和囊泡或液泡,而鲇精子的核后端与质膜间存在丰富的细胞质、线粒体和囊泡。

鲇精子头部植入窝的重要结构是中心粒复合体,由近端中心粒和远端中心粒构成,大多数硬骨鱼类精子的近端中心粒长轴和远端中心粒长轴垂直,即呈“T”形或“L”形。本研究中观察发现,鲇精子的近端中心粒长轴和远端中心粒长轴呈“T”形,与大多数硬骨鱼类精子的这一结构相似。但有研究发现,少数鱼类精子的近端中心粒长轴和远端中心粒长轴不垂直,如刀鲚Coilia ectenes[17]精子的近端中心粒长轴和远端中心粒长轴呈“一”字形;斜带石斑鱼[5]精子的近、远端中心粒长轴约成120°的夹角;长吻鮠Leiocassis longiorstrisGonther[14]精子的近端中心粒与精子纵轴亦不垂直,呈一定角度。由此可见,关于近端中心粒长轴和远端中心粒长轴的位置关系变化较大,目前其位置变化的生物学意义不明。

3.4 鲇与其他鲇形目鱼类精子超微结构的异同点

综合诸多学者研究发现,鲇形目鱼类的精子形态有两类不同的存在形式:一类是精子明显分为头、颈(又称中段)和尾3部分,如南方大口鲇[4]和索氏六须鲶Silurus soldatovi[18]等;另一类是精子只有头和尾两部分,精子颈部不明显或不存在,其精子的袖套和中心粒复合体紧靠精子头部存在,如鲇和革胡子鲶[3]。鲇形目鱼类精子的头部形态也有两种类型:一类是头部呈球形或椭圆形,如鲇、南方大口鲇[4]和革胡子鲶[3]等;另一类是精子头部呈长锥形,如埃及尼罗鲶Chysichthys auratus[11]。但无论哪种头部形态,目前未见鲇形目鱼类的精子头部存在顶体结构的报道。

有学者研究发现,长吻鮠[14]、黄颡鱼Pelteobngrus fulvidraco[18]等鲇形目鱼类的精子鞭毛外膜向两侧突出形成鳍状结构,而本研究中观察未见鲇精子尾部有鳍样结构存在。同时作者在鲇受精试验中发现,鲇精子无侧鳍依然运动迅速。推测鞭毛上的侧鳍结构对提高精子游泳效率的作用不大。作者分析认为,线粒体是细胞代谢的动力中心,精子运动的主要动力来源于其线粒体,线粒体的数目和代谢活动直接影响了精子活力及对成熟卵子的受精能力。

3.5 环境因素对精子活力的影响

环境因素是影响精子活力的重要因素,精子处于适宜环境条件下被激活,则有利于其活力增强。一般来说,大多数鱼类的精子在中性或弱碱性环境下活力较强,而在酸性环境下精子活力降低、存活时间缩短。如南方大口鲇精子在pH为8时活力较强[4],斜带石斑鱼精子在pH为8.7时活力较强[5]。本研究中发现,温度为26℃时,在不同pH的水体中,鲇精子的活力表现不同;当水体pH分别为7.5和8.0时,鲇精子的快速运动时间和存活时间最长,表明其精子活力最强;而当pH小于6.5或大于8.5时,鲇精子的快速运动时间和存活时间则迅速缩短,其精子活力也明显减弱。

温度对鱼类精子活力的影响较为复杂,目前无明确机制[5],一般认为,高温促进精子活力,低温抑制精子活力。本研究中发现,水体pH为8.0时,随水温升高,鲇精子的快速运动时间延长,而精子存活时间则缩短;当水温升至28℃时,鲇精子的快速运动时间达到最长(42.8 s);当水温为34℃时,鲇精子的快速运动时间下降,精子存活时间迅速缩短;当水温升至37℃时,鲇精子失活。这表明水温为28℃时,鲇精子活力最强,当水温高于34℃时,鲇精子活力明显减弱。

因此,开展鲇人工种苗繁育时,为提高鲇成熟卵子的受精率,使鲇精子活力达到最佳,鲇精子稀释用水最好为中性或弱碱性(pH值为7.0～8.5),受精时的水体温度应控制在25～29℃。

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Ultrastructure of spermatozoon and effects of pH and temperature on spermatozoon motility in oriental sheatfishSilurus asotus

QIAO Zhi-gang,LIU Shu-yan,SHEN Fang-fang
(Fisheries College,Henan Normal University,Xinxiang 453007,China)

The ultrastructure of spermatozoa of oriental sheatfishSilurus asotuswith body weight of320-550 g was observed by means of scanning electron microscopy(SEM)and transmission electron microscopy(TEM)and effects of pH and temperature on spermatozoonmotility in oriental sheatfish.The spermatozoawere shown to be primarily consists of head and flagellum,with no obvious neck.The spermatozoon has a round head with a diameter from 1.85μm to 2.51μm,containing highly condensed chromatin,without acrosome or acrosomal vesicles.There were fossa containing proximal centrioles and distal centrioles in the end of the head.There were rich cytoplasm, mitochondria,and vesica in sleeve distributed between unclei and plasmamembrane.The slender flagella consisting of axoneme and accessory fibers have length of44.3μm to 50.7μm,with a round cross section and a diameter of 0.269μm to 0.308μm.A typical structure of“9+2”modelwas observed in the axoneme and distal centrioles.Itwas found that7.0-8.5 pH was the suitable for spermatozoon,with the maximalmotility at 8.0 pH and that25-29℃was the suitable temperature for spermatozoon,themaximalmotility at28℃.

Silurus asotus;spermatozoon;ultrastructure;spermatozoon motility

Q952.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.06.003

2095-1388(2016)06-0602-05

2016-04-04

河南省科技成果转化项目(01046639096)

乔志刚(1965—),男,博士,教授。E-mail:hnsddsyy@126.com