提取动物组织DNA的方法比较

2016-02-08王戊腾安得霞

甘肃畜牧兽医 2016年23期

关键词：离心管无水乙醇废液

王戊腾，胡鹏，安得霞

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030）

提取动物组织DNA的方法比较

王戊腾，胡鹏，安得霞

（西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030）

传统方式提取DNA大多运用氯仿、苯酚以及异丙醇等其他相关的试剂，此提取DNA的方式纯度相对而言比较低，实验过程非常的复杂、耗时之多，并且还有可能产生毒性的物质。所以，运用商品化的试剂盒针对DNA进行提取，显得更加的简洁、便利。本文首先介绍了试剂盒提取DNA方法的相关内容，并以两种动物组织DNA提取方法的比较为具体的案例进行了分析。

DNA提取试剂盒；DNA；改进

1 引言

DNA是构成基因最主要的部分，在某个生物群体里面往往会共同具备着两个或者多个不持续的基因型、变异型以及等位基因等被叫做基因的多态性，其有着非常多的种类，例如：DNA序列的多态性、DNA长度的多态性以及单核苷酸的多态性等。

2 试剂盒提取DNA简介

2.1 基因组DNA提取的原则

确保核酸一级架构的整体性 (由于所有的遗传信息都储藏于核酸一级架构里面，因此较为全面的一级架构是确保核酸功能与结构分析的基石)。

排除其他类型的分子(例如：多糖、蛋白质以及脂类等)所造成的污染，使得接下来的实验能够成功地完成。

2.2 动物基因组DNA提取的方法

2.2.1 损伤性取样材料DNA的提取

2.2.1.1 乙醇保存的动物标本基因组DNA提取方式用乙醇保存动物标本是最为常见、效果最好的方式。因为大部分的DNA酶必须具备某个二价阳离子当做辅助的因子(例如：Ca2+、Mg2+等)，在70%的乙醇里面倒入合适数量的EDTA，EDTA能够在较短的时间内调控住DNA酶的活性，从而避免DNA所发生的降解。莫邦辉等人在酒精标本DNA模板迅速提取里面并未运用蛋白酶 K，只有在缓冲液 (0.5%SDS，10 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/LEDTA，pH 8.0)，37℃温浴1h之后消化相关的材料，同样得到了比较好的扩增效果，然而这样的方式只能够运用片段比较短的PCR扩增中去。通常而言，使用酒精标本提取DNA的方式均会加入一定量的蛋白酶K，同时56℃的温度之下消化8～14 h，以使得组织里面所含有的蛋白质全部消化。

2.2.1.2 甲醛溶液保存的动物基因组DNA提取方式在之前所进行的探索里面针对福尔马林标本的DNA提取方式做出了非常大的改善，在标本的预先处理过程中，主要有临界点干燥与梯度酒精浸泡这两种不同的形式。然而梯度酒精浸泡的方式造成乙醇和标本里面的甲醛发生反应形成缩醛与半缩醛等，接着经过酒精变换被过滤出去。徐来祥等人为了避免标本吸入较多的水分而导致细胞被损害，运用PBS溶液融合乙醇溶液对样品进行浸泡、洗脱，同样获得了比较好的成果[1]。在针对DNA进行提取的环节里面，周美玉与杜世章等人均均采取了抗氧化剂二硫苏糖醇(DTT)，DTT可以非常好的避免甲醛氧化成甲酸，然而甲酸同样会导致DNA出现降解，所以抗氧化剂的通入对于DNA的提取有着非常重要的意义。

2.2.2 非损伤性取样材料DNA的提取

2.2.2.1 从毛发里面提取DNA的方式从毛发里面获得DNA，与其有关的报道非常之多。余舰等人在蛋白酶K的作用之下，运用酚-氯仿反复抽提的形式便已由毛发里面获得极少数的DNA。徐艳春与伍新尧等人采取Chelex-100处理毛发提取DNA，然而运用这样的方式对于毛囊细胞的裂解并不充分，所遗留的消化液对于之后所进行的PCR实验有非常的负面影响[2]。之后，李军林等人以普通的酚-氯仿提取方式为基础进行改善，以pH 8.8Tris-HCl、MgCl2溶液与蛋白酶K作为裂解液进行消化，得到了品质比较高的DNA[3]。

2.2.2.2 从血液样本里面提取DNA的方式从血液里面取得DNA最为重要的便是清除掉里面所含有的蛋白质与红细胞等其他物质。通常所采取的方式为∶首先获得淋巴细胞，接着运用蛋白酶K、SDS进行消化，接着采取酚氯仿抽提进行提取、使用乙醇进行沉淀。然而这样的方式比较繁琐，同时所使用的试剂对于人们的健康有着较大的影响，因此有大量的专业人士对其作出了改善。赵权等人运用TritonX-100来对白细胞与红细胞进行破碎，直接获得白细胞核，接着运用Na-ClO4，SDS分解聚核蛋白，然而并未运用蛋白酶K，最终运用PCl(酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1)进行抽提，使用乙醇进行最后的沉淀。这样的方式能够更加好的去除红细胞[4]。

3 试剂盒提取DNA的步骤

3.1 开展试验之前所需要注意的几点

首次运用之前需要根据试剂瓶外所贴的标签指示首先在漂洗液PW与缓冲液GD里面倒入适量的无水乙醇。所选取的样品需要防止重复此能够的冷冻与溶化，不然会造成所提取出的DNA片段相对较小，提取的数量减低。如果缓冲液GB或者GA里面有沉淀物，能够将其置入56℃的水浴里面再次溶解，摇匀之后继续运用。全部的离心过程都需要运用台式的离心机，在室温背景下进行离心。

3.2 具体的操作步骤

3.2.1 处理相关的材料

3.2.1.1 如果所提取的材料是血液，能够直接运用200μL冷冻、新鲜或者是融入各式各样抗凝剂的血液，如果没有200μL能够加入适量的缓冲液GA进行补充。

3.2.1.2 若所需处理的血样是鸟类、禽类以及两栖类等其他更加低级生物的抗凝血液，他们的红细胞是有核细胞，所以处理量在5～20μL的范畴以内，能够加入缓冲液GA达到200μL之后实施以下的裂解过程。

3.2.1.3 由贴壁培养所获得细胞首先需要处理成细胞悬液，10 000 rpm(-11 200×g)离心1 min，去处上清，倒入200μL缓冲液GA，不停的振荡直到完全的悬浮。

3.2.1.4 动物组织（脾组织的用量需要低于10 mg）首先需要打碎成细胞悬液，接着放入10 000 rpm(-11 200× g)离心1 min，去处上清，倒入200μL缓冲液GA，不停的振荡直到完全的悬浮。

3.2.2 倒入20μL的蛋白酶K溶液，摇晃均匀

3.2.2.1 在提取血液基因组的时候，仅仅需要加入蛋白酶K摇晃均匀，便能够进入一下道程序。

3.2.2.2 在提取细胞基因组的时候，仅仅需要加入蛋白酶K摇晃均匀，便能够进入一下道程序。

3.2.2.3 在提取组织基因组的时候，加入蛋白酶K摇晃均匀之后，进行56℃水浴，直到所有的组织全部溶解，简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠，再进入下一道程序。

3.2.3 倒入200μL的缓冲液GB，全面颠倒使其均匀，在70℃中搁置10 min，溶液变得非常的清亮，简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠。

3.2.4 倒入200μL的无水乙醇，全面振荡混匀15 s，这个时候或许会形成絮状的沉淀物，简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠。

3.2.5 将以上所获得的溶液与絮状的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面，接着再将吸附柱置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，过滤掉废液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.6 往吸附柱CB3里面倒入500μL的缓冲液GD（在运用之前首先需要检验是不是已经倒入了无水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，过滤掉废液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.7 往吸附柱CB3里面倒入600μL的漂洗液PW（在运用之前首先需要检验是不是已经倒入了无水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，过滤掉废液，把吸附柱CB3置入收集管里面。

3.2.8 重复执行步骤7。

3.2.9 把吸附柱CB3置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，过滤废液。把吸附柱CB3放入室温里面几分钟的时间，以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液。

3.2.10 把吸附柱CB3转移到其他未使用过的离心管里面，接着往吸附膜的中间区域悬空滴入50～200 μL的洗脱缓冲液TE，室温摆放2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，将所有的溶液采集到离心管里面。

4 两种动物组织DNA提取方法的比较

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.1.1 试验样本此次试验所运用的猪肉组织都源自于在售的新鲜动物，在完成样品收集之后储藏在-80℃的冰箱里面。

4.1.1.2 试验试剂以及相关的设备血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；漩涡混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；微型离心机（杭州米欧仪器有限公司）；FA2004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；SP-1900UV型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

4.1.2 实验方法

4.1.2.1 酚-氯仿抽提一是取50 mg猪肉组织剪碎之后置入1.5 mL的离心管里面，倒入400μL的裂解液、200μL的lSDS以及20μL的蛋白酶K，经过56℃的水浴消化之后过夜处理；二是往里面加入相同体积的饱和酚，充分摇晃5～6 min，静静的搁置5 min，12 000 r/min离心10 min；三是细致的提取上清部门转移到全新的1.5 mL的离心管里面，融入相同体积的体积比是25饱和酚∶24氯仿∶1异戊醇，充分摇晃至均匀，静静的搁置4～5 min，12 000 r/min离心10 min；四是细致的提取上清部门转移到全新的1.5 mL的离心管里面，融入相同体积的体积比是24氯仿∶1异戊醇，充分摇晃至均匀，静静的搁置4～5 min，12 000 r/min离心10 min；五是细致的提取上清部门转移到全新的1.5 mL的离心管里面，倒入2倍的无水乙醇，（无水乙醇需要提前摆放于-20℃的环境中冷冻5～10 min），12 000 r/min离心10 min；六是排除无水乙醇，倒入1 mL的75%乙醇，反复吹打，12 000 r/min离心10 min，此步骤需要重复1次；七是通风、干燥5～10 min，倒入50μL的纯水。

4.1.2.2 试剂盒提取一是取50 mg猪肉组织剪碎之后置入1.5 mL的离心管里面，融入200μL的缓冲液GA，倒入20μL蛋白酶K摇晃均匀之后，进行56℃水浴，直到所有的组织全部溶解；二是倒入200μL的缓冲液GB，全面颠倒使其均匀，在70℃中搁置10 min，溶液变得非常的清亮，简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠；三是倒入200μL的无水乙醇，全面振荡混匀15 s，这个时候或许会形成絮状的沉淀物，简单的离心以清除悬挂在管盖内部的水珠；四是将以上所获得的溶液与絮状的沉淀物均融入到吸附柱CB3里面，接着再将吸附柱置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，过滤掉废液，把吸附柱CB3置入收集管里面；五是往吸附柱CB3里面倒入500μL的缓冲液GD（在运用之前首先需要检验是不是已经倒入了无水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）离心30 s，过滤掉废液，把吸附柱CB3置入收集管里面；六是往吸附柱CB3里面倒入600μL的漂洗液PW（在运用之前首先需要检验是不是已经倒入了无水乙醇），12 000rpm（～13 400×g）离心30 s，过滤掉废液，把吸附柱CB3置入收集管里面，重复再做一次；七是把吸附柱CB3置入收集管里面，12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，过滤废液。把吸附柱CB3放入室温里面几分钟的时间，以充分晾干吸附材料里面所剩下的漂洗液；八是把吸附柱CB3转移到其他未使用过的离心管里面，接着往吸附膜的中间区域悬空滴入150μL的洗脱缓冲液TE，室温摆放2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）离心2 min，将所有的溶液采集到离心管里面。能够直接开展PCR反应。

4.1.3 DNA浓度与纯度的检测

运用核酸蛋白定量仪检测DNA样品的OD260、OD280吸光度具体数值同时测定DNA的浓度与纯度（如表1所示）。

4.1.4 PCR扩增实验

表1 两种DNA提取方法的浓度及纯度

猪cytb基因引物所设计的序列为：上游5′CACGACCAATGACATGAAAAATC3′，下游5′GCTGCGAGGGCGGTAAT3′。PCR的反应过程如下：PCR反应总体系是50μL，PCR反应组成成分主要有以下几种：其间 10×Buffer 5μL，10 mmol/LdNTP 4μL, 12.5μmol/L上下游的引物均为1.5μL，ExTagDNA聚合酶2U，倒入超纯水直到50μL。PCR所必备的反应条件如下：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，一共有35个重复过程，最终72℃延伸10 min，温度降调4℃储藏。御用酚-氯仿抽提的方式所获得的DNA置入4℃的温度中储藏3～5 d之后，进行PCR扩增。采取试剂盒所获得的DNA能够直接进行PCR扩增。

4.1.5 琼脂糖电泳检测

4.1.5.1 基因组DNA的检测运用1%的琼脂糖电泳检查两种方式所提取出的DNA，见图1。

图1 两种方法提取的基因组DNA电泳结果比较

4.1.5.2 PCR扩增的检测运用1%的琼脂糖电泳检查扩增的结果，见图2。

4.2 结果

4.2.1 DNA纯度、浓度的测定结果从以上两种方式所测得的DNA纯度层面来看，酚-氯仿抽提是1.58±0.18，试剂盒提取法是1.74±0.15，两者之间的差距非常明显（P＜0.05），试剂盒所提取出的DNA纯度更加接近于1.8。从DNA的浓度层面来看：酚-氯仿抽提法时120±25μg/mL，试剂盒提取法是112±11μg/mL，两者之间没有太大的差距。