陈黄曌，刘延波，余海尤，邓晓旭，王永芬

（河南牧业经济学院生物工程学院，郑州 450046）

研究基因沉默途径的几种筛选系统概述

陈黄曌，刘延波，余海尤，邓晓旭，王永芬

（河南牧业经济学院生物工程学院，郑州 450046）

在真核生物中，基因表达的表观遗传控制，在应对病毒入侵、转座子易位和转基因片段插入过程中，发挥着重要作用。在植物中，转基因和内源基因的沉默，主要通过转录基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）或者转录后基因沉默途径（posttranscriptional gene silencing，PTGS）。TGS通常是由转入基因的多拷贝或由转基因片段插入到了染色体的特定区域引起的，受内源基因启动子启动的转基因表达，可能会导致转基因及该内源基因的沉默，该过程可能通过RNAs介导完成。拟南芥属双子叶开花植物，花期较短，且已经完成全基因组测序及注释工作。目前，作为一种模式研究植物，植物表观遗传学研究者利用拟南芥，通过遗传筛选结合蛋白和分子生物学方法，研究DNA甲基化、组蛋白修饰和基因表达调控的表观遗传分子机制，通过构建不同的筛选系统发现，参与到RdDM（RNA-directed DNA methylation）及其它途径中的新基因，并借助转录组学和蛋白组学研究工具，具体阐明该新发现基因，在整个甲基化调控中的作用机理。文章以甲基化调控为研究对象，对当前具有代表性的筛选系统做概括介绍。

DNA甲基化 基因沉默 RdDM 筛选系统

与原核生物不同，真核生物的遗传信息储存，在以组蛋白八聚体包裹着DNA组成的核小体中，并以染色质形式存在。因此，基因的表达调控就不可避免地受到DNA和组蛋白表观遗传修饰的影响，尤以DNA甲基化修饰最为常见［1］。DNA甲基化是指，在胞嘧啶碱基端添加一个甲基基团。在哺乳动物中，DNA甲基化专一性的发生在对称的CG背景下，占到了整个基因组比例的70%～80%；在植物中，DNA甲基化发生在以下的序列背景：对称的CG、CHG和不对称的CHH（H = A T or C）。其中，CG和CHG序列背景下的甲基化，主要是由MET1 和CMT3两个基因编码蛋白维持的，而CHH序列背景下的DNA甲基化则由DRM2基因编码蛋白从头合成来维持的，与哺乳动物不同，植物中DNA甲基化，主要发生在转座子和其它DNA重复序列原件［2］。

植物中DNA甲基化的从头合成，最初被发现是由小RNA介导的［3］，目前已被命名为RdDM（RNA指导下的DNA甲基化）途径，PolIV和PolV（DNA依赖的RNA聚合酶）是植物所编码特有的两个聚合酶，也是RdDM所必需的［4］。在RdDM途径中，由PolIV转录产生的单链RNA，经RDR2（RNA依赖的RNA聚合酶）基因编码蛋白被合成双链，之后，由DCL3基因编码蛋白被加工为24 nt siRNA，并以单链形式被转载到AGO4蛋白上，形成AGO-siRNA复合体。同时，由PolV在靶位点转录产生的非蛋白编码基因转录本作为支架［5］。研究表明，KTF1基因编码蛋白可以结合由PolV转录产生的scaffolds，并招募AGO4蛋白形成AGO-siRNA复合体，并与IDN2蛋白和DDR复合体形成更大的RdDM效应子蛋白复合体，之后，该效应子蛋白复合体，通过一种未知的机制招募到DNA甲基转移酶和组蛋白甲基转移酶到基因组特定位点，从而实现对靶位点的甲基化沉默［6］。

1 RD29Apro：LUC 筛选系统

RD29A是植物逆境胁迫应答基因，启动子区域含有ABA、干旱、盐和冷胁迫应答元件［7］。朱健康实验室将RD29A启动子与LUC基因连接，构建成为RD29Apro：LUC表达系统转入到野生型拟南芥C24中，转基因的拟南芥因此获得2个甚至以上RD29A启动子的拷贝数。经过多代筛选后，获得RD29A-LUC转基因稳定表达的株系，对该株系进行EMS诱变处理后，在M2代中，经过盐处理后筛选异常发光的突变体［8］，经过筛选发现其中一个突变体，在经过盐胁迫处理后，失去发光能力。以此，将该突变体命名为ros1。通过图位克隆，对该位点进行精细定位，并进行克隆测序，结果显示，该ROS1基因编码具有Ⅲ型核酸内切酶功能域核蛋白，和参与DNA损伤修复的HhH-GPD超家族蛋白，具有显著的相似性。关于其功能的描述有两种假说：一种认为ROS1蛋白可能参与阻止由smRNAs引发的DNA甲基化反应；另一种学说则认为ROS1蛋白直接作用DNA的去甲基化反应，从而抑制特定DNA序列的过度甲基化水平［9］。该实验结果得出的结论与后一种假说一致，在ros1突变体中，由于ROS1蛋白去甲基化功能的缺失，整个基因组甲基化水平处于较高的状态，因此，转基因被沉默，报告基因不会发出荧光。在此基础上，以该ros1突变体为背景，实验室又构建出一种筛选系统，即RD29Apro：LUC/ros1筛选系统。

2 SDCpro：GFP筛选系统

研究表明，SDC（Suppressor of drm2cmt3）基因在拟南芥多个组织中的表达，受到DRM2和 CMT3的表达抑制，因此，SDC的表达沉默在drm2cmt3双突变体中，而非各自单突变体中能够得到释放，SDC基因启动子区域含有7个串联重复区域，可招募结合DNA甲基化蛋白，进而引起该基因的沉默。通过分子操作实验，将SDC启动子和绿色荧光蛋白GFP连接构建融合表达筛选系统，将含有该SDCpro：GFP的融合载体，通过农杆菌侵染转入野生型拟南芥中，由于SDC启动子区域串联重复序列的存在，转基因拟南芥中GFP基因的表达因此被沉默，通过EMS突变处理后，从中筛选出GFP基因表达沉默被释放的突变体。Steven E. Jacobsen实验室通过该种方法，成功寻找到参与到甲基化沉默途径的新基因AtMORC6［10］。研究表明，基因编码蛋白含有一保守的腺苷三磷酸酶结构域［11］，可能参与了染色质超级结构的重塑化过程，其作用机理可能是通过与RdDM途径中的DMS3蛋白相互作用，参与到RdDM过程，实现对转录抑制的调控，也有的研究直接将AtMORC6/DMS11列为RdDM作用机制中的一个新成员基因。AtMORC6基因的发现证明，SDCpro：GFP筛选系统，可以成功的用于筛选参与甲基化调控途径的新成员基因，且SDC作为RdDM途径直接作用的靶位点［12］，受甲基化影响而沉默，使得该筛选系统更具有针对性。该系统的创新之处，就在于利用植物了内源基因，启动子区域特有的重复序列结构，作为研究途径的靶位点两大优势，特异性地筛选新功能基因。

3 d35S：LUC-AP2筛选系统

LUC（LUCIFERASE）常作为报告基因被转入作为水稻和烟草中，通过与底物反应发出荧光，借此研究转基因表达。陈雪梅实验室将两个35S启动子串联排列，分别启动LUC和NPTⅡ（抗性筛选标记）基因表达，构建双元35S启动子融合荧光素酶表达系统构建筛选系统，并与LUC基因末端融合一段AP2序列。该AP2序列包含miR172 结合位点，形成d35S：LUC-AP2和d35S：NPTⅡ结构。该系统同时筛选分别参与RdDM和miRNAs介导的转录后基因沉默途径的新基因，为消除转录后基因沉默造成的影响，该表达系统通过农杆菌被转入到rdr6突变体中［13-14］，分离得到LUC信号中等强度水平的株系，将其命名为LUCH（LUC repressed by CHH methylation），通过EMS诱变处理后，从中筛选荧光信号高和低强度的突变体，并通过该系统筛选得到已知的参与DNA甲基化修饰的MOM1和ROS1等基因。除此之外，该系统同时筛选得到一新基因AMP1。该基因编码产物为一膜整合蛋白，与内质网和AGO1相关联，AGO1是与膜相关的主要miRNAs效应子蛋白［15］，表明该蛋白主要参与拟南芥miRNAs介导的翻译抑制过程［14］，miRNAs主要通过作用于target mRNAs实现翻译的抑制调控。但，该发生过程的亚细胞定位一直没有被阐明，通过对AMP1亚细胞定位的鉴定和miRNAs作用的target mRNAs的分布研究，证实了miRNA介导的翻译抑制过程发生在内质网上。

目前，文献已报道的筛选系统，远不止于以上3种，调控植物甲基化的方式也不止于RdDM、

DDM1等。从就目前已经报道的筛选系统所得到的结果可看出，某些基因，如典型的RdDM途径蛋白AGO4及不依赖于RdDM途径的MOM1蛋白，在不同的筛选系统中，几乎都可以被重复筛到，表明基因沉默的机理本身十分复杂，不同的沉默途径之间并不是严格独立的，相互之间可能存在着功能上的部分重叠，甚至是相互作用。随着研究的深入，多数筛选系统对新基因的发掘趋于饱和，使新基因的发掘越来越有限。未来的研究，可能要通过构建更加具有针对性的筛选系统，对介导甲基化沉默的不同通路之间的相互作用，进行深入探究，进一步揭示表观遗传学的分子机理。

［1］ Law J A，Jacobsen S E . Establishing，maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals. Nature reviews Genetics，2010，（11）：204～220

［2］ Zhang X，Yazaki J，Sundaresan A，et al. Genome-wide high-resolution mapping and functional analysis of DNA methylation in arabidopsis. Cell，2006，（126）：1189～1201

［3］ Wassenegger M，Heimes S，Riedel L，and Sanger，et al. RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants. Cell，1994，（76）：567～576

［4］ Matzke M，Kanno T，Daxinger L，et al. RNA-mediated chromatinbased silencing in plants. Current opinion in cell biology，2009，（21）：367～376

［5］ Zheng B，Wang Z，Li S，et al. Intergenic transcription by RNA polymerase II coordinates Pol IV and Pol V in siRNA-directed transcriptional gene silencing in Arabidopsis. Genes & Development，2009，（23）：2850～2860

［6］ Cao X，Aufsatz W，Zilberman D，et al. Role of the DRM and CMT3 methyltransferases in RNA-directed DNA methylation. Current biology ：CB，2003，（13）：2212～2217

［7］ Ishitani M，Xiong L，Stevenson B，et al. Genetic analysis of osmotic and cold stress signal transduction in Arabidopsis： interactions and convergence of abscisic acid-dependent and abscisic acid-independent pathways. Plant Cell，1997，（9）：1935～1949

［8］ Gong Z Z，Rafael R. Ariza，et al. ROS1，a Repressor of Transcriptional Gene Silencing in Arabidopsis，Encodes a DNA Glycosylase/Lyase. Cell，2002，（111）：803～814

［9］ Lindahl T，Wood R D. Quality control by DNA repair. Science，1999，（286）：1897～1905

［10］ Guillaume M，S J C，Joshua C，et al. MORC Family ATPases Required for Heterochromatin Condensation and Gene Silencing. Science，2012，（336）

［11］ Moissiard G，Cokus S J，Cary J，et al. MORC family ATPases required for heterochromatin condensation and gene silencing. Science，2012，（336）：1448～1451

［12］ Henderson I R，Jacobsen S E. Tandem repeats upstream of the Arabidopsis endogene SDC recruit non-CG DNA methylation and initiate siRNA spreading. Genes & Development，2008，（22）：1597～1606

［13］ Dalmay T，Hamilton A，Rudd S，et al. An RNA-dependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell，2000，（101）：543～553

［14］ Peragine A ，Yoshikawa MG，Albrecht HL，et al. SGS3 and SGS2/ SDE1/ RDR6 are required For juvenile development and the production of transacting siRNAs in Arabidopsis. Genes Dev，2004，（18）：2368～2379

［15］ Brodersen P，Sakvarelidze-Achard L，Schaller H，et al. Isoprenoid biosynthesis is required for miRNA function and affects membrane association of ARGONAUTE 1 in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，（109）：1778～1783