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动物皮张基因组DNA三种提取方法比较

2016-02-05刘艳艳东野升金王想想卞如如陈杰范阳阳张全芳步迅

山东农业科学 2015年12期

刘艳艳++东野升金++王想想++卞如如++陈杰++范阳阳++张全芳++步迅

摘要:以干燥的驴皮张样品为试验材料,将SDS-蛋白酶K法与Chelex-100法相结合,创新性地引入玻璃奶DNA纯化技术,提取全基因组DNA,并将此方法与前人发表的陈旧皮张DNA提取方法和试剂盒提取方法进行比较分析。结果表明,本研究发明方法提取的基因组DNA纯度较高,杂质较少,且操作简单,所用试剂、仪器费用较低,能更好地应用于分子生物学实验。

关键词:动物皮张;DNA提取;玻璃奶

中图分类号:Q78 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2015)12-0006-04

DNA为分子生物学研究的基础,随着生物领域尤其是遗传学方面研究的日渐深入,从分子水平上对动物进行物种鉴定、物种起源和多样性评估及其亲缘关系研究已获得广泛应用。20世纪80年代就已开始动物皮张标本DNA提取的研究,尽管提取成功的报道很多,但提取的基因组DNA含量较低,片段较短,且难以进行PCR扩增;提取方法虽然不断改善,但得到的DNA质量仍旧不是很高。

当前皮张源性鉴定方法滞后,国内外仍然没有统一的技术标准和较成熟的鉴别方法,传统的宏观观察法、显微镜观察法具有一定的主观性,无法准确和快速地区分皮张源性。随着分子生物学技术的发展,基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来。DNA分子鉴定法主要是利用显示生物特征的各生物物种所具有的不同DNA序列信息进行源性鉴别,它可以突破依据动物纤维结构形态进行鉴定的局限性,与传统分析方法相比,更加客观和准确。因此,获得高质量的动物皮张基因组DNA已成为进行皮张源性鉴定研究的迫切要求。

本试验以SDS法为基础,将蛋白酶K、Chelex -100与Glass Milk DNA提取技术相结合,并将此方法与前人发表的陈旧皮张DNA提取新方法和DNA提取试剂盒法进行比较分析,旨在研建一种操作简便、DNA提取效率高、花费较为低廉的优化方法,为后续分子生物学实验提供必要条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

9份干燥的驴皮样品,分别编号为1~9。每份样品平均分为三份,分别用于A、B、C三种方法。材料由山东省农业科学院生物技术研究中心测序中心提供。

1.2 试验试剂

(1)消化缓冲液A(10mmol/L Tris-HCl,25mmol/L EDTA, 100mmol/L NaCl,0.5%SDS, pH8.0)、Chelex-100、20mg/mL蛋白酶K、氯仿、Glass Milk、DNA Binding Buffer、70%酒精、无水乙醇、TE缓冲液、超纯水。

(2)消化缓冲液B(10mmol/L Tris-HCl,0.5% SDS,1mmol/L CaCl2,0.2mg/mL蛋白酶K, pH 8.0)、1μmol/L EDTA、10% Chelex溶液、酚、氯仿、异戊醇、3mol/L NaAc、无水乙醇、75%酒精、TE缓冲液、超纯水。

(3) DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TissueDNA Kit)。

(4) HiFi Buffer: TransTaq DNA PolymoraseHigh Fidelity购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA提取 方法A:取约30mg驴皮样品研磨至微粒,分别装到编号为A1~A9的2mL EP管中,加1mL去离子水洗涤2次;加入400μL消化缓冲液A以及380μL5%的Chel-ex-100和20μL 20mg/mL的蛋白酶K,50~600C水浴保温,期间搅拌混匀,至全部溶解;取出冷却至室温,振荡5~10s,100℃沸水浴8min;结束后取出样品,10000r/min离心1min,取上清转至新的EP管(记录上清体积),加等体积氯仿,充分混匀,12000r/min离心5min,重复此步骤两次;向收集液中加入5μL Glass Milk,并加600μL DNA Binding Buffer.充分混匀,65℃水浴15min;后室温放置5min,8000r/min离心1min,弃上清;加入70%酒精500μL进行洗涤,8000r/min离心1min,重复此步骤两次;加入500μL无水乙醇,吹打悬浮,8000r/min离心1min,弃上清;8000r/min离心30s,用10μL枪头吸走残余液体,室温干燥10min;加入50μL TE缓冲液(pH 7.0),70℃水浴5min,快速离心,移至新离心管,- 200C保存。

方法B参考陈旧皮张DNA提取新方法[12]。

方法C参考DNA提取试剂盒(E.Z.N.A.Tissue DNA Kit)。

1.3.2 基因组DNA检测 (1)紫外分光光度计检测:每份DNA样品分别取2μL测定其浓度及A260和A280。每个样品做三个生物学重复,取均值。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测:配置2.0%的琼脂糖凝胶,取1×Loading Buffer 10μL,加入2μL基因组DNA样品,混合均匀后加入点样孔中,同时加入DNA Marker,180V电泳10min。电泳结束后,利用凝胶成像仪进行拍摄,保存图像,根据样品的条带亮度、整齐度及位置,粗略估计其纯度及片段大小。

(3) PCR扩增检测:根据驴线粒体基因组(16S rRNA)细胞色素b特异序列,利用PrimerPremier 5.0设计PCR引物,上游引物MtUF:5' -ATAAGACGAGAAGACCCTATCCAGC -3',下游引物MtUR:5-ACCAITITCTGITCTCCGAGGTCAC -3',扩增目的片段250 bp。在扩增之前分别将三种方法提取的共27份基因组DNA稀释到100 ng/yL待用。PCR反应总体积为25μL,其中ExTaq聚合酶0.2μL,HiFi Buffer 2.5μL,dNTP 2.0μL,上游引物1.0μL,下游引物1.0μL,模板2.0μL,ddH20 16.3μL。endprint

2 结果与分析

2.1 三种方法提取的基因组DNA紫外分光光度计检测

由表1可知,A、B、C三种方法获得的DNA质量在A260和A280值上有明显区别,B方法的A260值最高达100以上,A280值最高也达到50以上;C方法虽然A260和A280值比B方法稍低,但总体上数值仍然偏高。原因可能是B和C两方法提取的DNA纯度不高,含有较多苯酚、盐酸胍、聚乙二醇等杂质。过多的杂质污染进而导致样品浓度过高,两方法获得DNA浓度均大于500ng/μL,远高于方法A的DNA浓度。利用方法A提取的DNA浓度范围为74.8~177.5ng/μL,A260/A280在2.0左右,虽仍有部分RNA污染,但DNA纯度相对B、C两方法要好。

2.2 三种方法提取的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳分析

从琼脂糖凝胶电泳图可以看出,三种方法均可从驴皮张中提取出基因组DNA,但获得的DNA量有显著差别。其中A方法的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图条带最弱,出现拖带现象,提取量最少(图1);B方法的基因组DNA提取量相对A方法稍多,但DNA降解较为严重,且杂质较多,不够纯净(图2);C方法的基因组DNA提取量相对于A、B两方法最多,条带最为明亮,提取效果最好,但存在降解现象及RNA等杂质污染(图3)。

2.3 三种方法提取的基因组DNA的PCR扩增检测

以三种方法提取的基因组DNA为模板,设计合成的引物扩增目的片段。由图4~6可知,三种方法均能很好地进行目的片段的扩增,且条带清晰,带型整齐,说明三种方法均能从干燥的驴皮张中提取较好质量的基因组DNA,且都能够应用于后续的分子生物学实验。

3 结论与讨论

玻璃奶是一种特殊制备的以二氧化硅作为悬浮物的水溶液,具备快速、定量、特异性结合DNA的能力,可以取代有毒的有机物苯酚、氯仿等用于分离和纯化DNA。在高盐溶液中,核酸是不溶的,可被吸附至玻璃基质上,而蛋白质在高盐溶液中是高度溶解的,脂类物质悬浮于溶液表面,从而起到纯化分离DNA的作用。将二氧化硅用于DNA的纯化最早见于Engelstein等的报道,他们采用此法纯化出了测序级的模板DNA。该法不仅杜绝了如酚、氯仿等对身体有毒害药品的使用,而且可达到高效、快速、批量提取DNA的目的,具有经济、实用、高效、无毒的特点。本研究利用SDS-蛋白酶K结合Chelex-100法提取动物皮张中的微量DNA,能获取较高浓度的DNA,进一步利用玻璃奶DNA纯化技术能显著去除残留的蛋白和金属离子等污染,显著提高了DNA纯度。

将本研究使用Chelex-100结合玻璃奶提取驴皮张全基因组DNA的方法与前人报道方法和试剂盒法提取所得基因组DNA分别利用紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳以及PCR扩增技术进行评估,综合分析可知,A方法所提基因组DNA虽然量较少但纯度较高,电泳均能显示出条带,并且能够很好地扩增目的片段,满足分子生物学实验要求,此外,所用试剂、仪器费用较低且操作较为简单,耗时14小时,相对B方法时间较短。B方法获取的基因组DNA浓度较高,也能用于PCR扩增目的条带,虽然操作以及仪器试剂和A方法相似,但基因组DNA电泳条带及吸光值显示其存在蛋白质、RNA以及其他杂质污染,且电泳条带也不是很整齐,耗时20小时,时间相对较长。C方法所提基因组DNA浓度居中,条带清晰整齐,能很好地进行目的片段PCR扩增,但从其吸光值来看,可能存在较多的酚、聚乙二醇、盐酸胍等杂质污染,且试剂盒价格相对较为昂贵。

综上所述,本研究三种方法均可用于干燥动物皮张基因组DNA的提取,通过对比分析,方法A即本研究发明的SDS -蛋白酶K结合Chelex-100法和玻璃奶纯化技术提取获得的基因组DNA纯度较高,杂质较少,且操作简单,所用仪器、试剂均价格低廉,相对于方法B和C能更好地应用于分子生物学实验。endprint