刘 称，王英超，金 红，马晓雨，史雪艳

（1. 天津农学院 a. 农学与资源环境学院，b. 基础科学学院，天津 300384）

牛蒡子中牛蒡苷的超声提取工艺优化研究

刘 称1a，王英超1b,通信作者，金 红1a，马晓雨1a，史雪艳1a

（1. 天津农学院 a. 农学与资源环境学院，b. 基础科学学院，天津 300384）

利用超声法对牛蒡苷最佳提取条件进行优化研究。考察超声功率、超声时间、超声温度、料液比等因素对牛蒡苷提取率的影响，并采用正交试验优化提取条件。结果表明：粒径为100目、提取溶剂为95％乙醇、预浸泡时间2 h、料液比1∶150（g∶mL）、超声时间45 min、超声功率114 W、超声温度70 ℃为最佳提取条件。在最佳提取条件下，进行了3组平行验证试验，牛蒡苷的平均提取率为12.69％。与其他超声提取工艺相比，牛蒡苷提取率至少提高1.89％。

牛蒡子；牛蒡苷；含量测定

牛蒡子（Arctium lappaL．）为菊科植物牛蒡的干燥成熟果实[1]。牛蒡苷为牛蒡子的主要有效成分[2-5]，具有免疫调节、抗菌、抗病毒等多种生理功能[6]。常见牛蒡苷的提取方法有加热回流法[7]、超临界萃取法[8]。加热回流法的提取时间一般较长，提取效率低；而超临界萃取法须将极性较大的牛蒡苷水解为极性较小的牛蒡苷元才能提取的较为完全，提取步骤比较繁琐。超声波作为一种有效的提取技术，具有简单、高效、低成本的特点，越来越多的应用于天然产物的提取中。

关于牛蒡苷超声提取工艺研究报道较少，仅见武娟霞等[9]和吴杨等[10]利用超声工艺提取牛蒡苷的研究。武娟霞等利用超声法提取牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷元，考察了超声功率、液固比、提取时间、提取温度等因素对牛蒡苷及牛蒡苷元提取率的影响，得到牛蒡苷的提取率为9.24％。吴杨等采用正交试验的方法，对牛蒡子的超声提取工艺进行优化。选择乙醇浓度、乙醇倍数、提取时间和粉碎粒度4个因素，采用L9（34）进行正交试验，所得牛蒡苷的提取率为10.8％。上述提取工艺所得牛蒡苷提取率较少，小于11％，且研究多集中在对超声的参数设置上，对于原材料牛蒡子的筛选及用提取溶剂预浸泡牛蒡子粉末未见文献报道。笔者在前人研究的基础上，利用超声法提取牛蒡苷，通过前期对牛蒡子筛选除杂及用提取溶剂预浸泡牛蒡子粉末，增加与溶剂的接触时间，并考察超声功率、温度等因素对牛蒡苷提取率的影响，以期得到较高提取率的牛蒡苷提取工艺，为牛蒡苷在食品及药品方面的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

牛蒡子：购自甘肃省陇西。挑选外观整齐一致，颗粒饱满的牛蒡子，水洗除去泥土等杂质，60 ℃烘干4 h，备用。

1.2 试剂

95％乙醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）购自天津市风船化学试剂科技有限公司；甲醇（色谱纯）购自Fisher Scientific；乙酸乙酯、丙酮购自天津市江天化工技术有限公司；牛蒡苷标准品（纯度＞96％）购自中国食品药品检定研究院（批号：110819-201510）。

1.3 仪器与设备

1200 Series Agilent 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；FA-2004电子天平（上海方瑞仪器有限公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水仪（美国密理博（中国）有限公司）；Elmasonic P超声波清洗器（380 W，德国艾尔玛公司）；L550低速离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响

选取40、60、80、100、120目的牛蒡子粉末各0.2 g，按料液比1∶150（g∶mL）加甲醇30 mL于50 mL三角瓶中，304 W超声提取20 min。待提取结束后，4 000 r/min 离心5 min。上清液过0.22 μm有机滤膜，滤出液作为高效液相色谱仪进样样品使用。以牛蒡苷的提取率为评价指标，探讨不同粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响。牛蒡苷的提取率（％）＝样品中牛蒡苷的含量（mg/mL）×提取液总体积（mL）×100÷取样量（g）÷1 000。

1.4.2 溶剂对牛蒡苷提取率的影响

选取100目的牛蒡子0.2 g，按料液比1∶150分别加入甲醇、无水乙醇、95％乙醇、乙酸乙酯、丙酮于各个三角瓶中进行超声提取，功率304 W，时间35 min。后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同的提取溶剂对牛蒡苷提取率的影响。

1.4.3 预浸泡时间对牛蒡苷提取率的影响

选取100目的牛蒡子粉末0.2 g，按料液比1∶150加入30 mL 95％乙醇，按照预浸泡时间0、2、4、6、12、24 h对牛蒡子粉末进行处理。待预浸泡相应时间后，304 W功率下超声35 min，后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同的预浸泡时间对牛蒡苷提取率的影响。

1.4.4 超声时间对牛蒡苷提取率的影响

选取100目的牛蒡子粉末0.2 g，按料液比1∶150加入30 mL 95％乙醇，预浸泡时间2 h，304 W功率下分别超声15、25、35、45、55 min，后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同的超声时间对牛蒡苷提取率的影响。

1.4.5 超声温度对牛蒡苷提取率的影响

选取100目的牛蒡子粉末0.2 g，按料液比1∶150加入30 mL 95％乙醇，预浸泡时间2 h，304 W功率下分别在40、50、60、70、80 ℃下超声35 min，后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同的温度对提取牛蒡苷率的影响。

1.4.6 超声功率对牛蒡苷提取率的影响

选取100目的牛蒡子粉末0.2 g，按料液比1∶150加入30 mL 95％乙醇，预浸泡时间2 h，温度70 ℃。超声功率按照最大功率380 W的30％、40％、50％、60％、70％即114、152、190、228、266 W下超声35 min，后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同的超声功率对牛蒡苷提取率的影响。

1.4.7 料液比对牛蒡苷提取率的影响

选取100目的牛蒡子粉末，按照料液比1∶300、1∶150、1∶50、1∶30、1∶20加入95％乙醇，预浸泡时间2 h，温度70 ℃，超声功率152 W功率下超声35 min，后续操作按照1.4.1中的方法进行，探讨不同料液比对牛蒡苷提取率的影响。

1.4.8 色谱条件

分离柱：Agilent XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.6 μm）；流动相：甲醇-水（V甲醇:V水＝1:1.1）；流速：0.5 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μL。

1.4.9 牛蒡苷标准曲线的制作

将1.5 mg/mL的牛蒡苷标准品稀释成浓度为0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mg/mL，按照其上述色谱条件进行试验，以峰面积为纵坐标，牛蒡苷的浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.4.10 正交试验

以单因素试验为基础，选择超声温度、功率、料液比、超声时间4因素，进行4因素3水平正交试验设计，见表1。

表1 4因素3水平正交试验设计

1.4.11 数据统计分析

采用Excel 2003和SPSS13.0软件进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 牛蒡苷标准曲线

牛蒡苷标准曲线见图1。从图1可以看出，牛蒡苷标准曲线方程：y＝ 1 714.8x＋25.031，R2＝0.999 1。y代表峰面积，x代表牛蒡苷浓度（mg/mL）。

图1 牛蒡苷标准曲线

2.2 牛蒡苷标准品及样品液相色谱图

牛蒡苷标准品液相色谱图及样品色谱图分别见图2和图3。从图2看出，0.5 mg/mL牛蒡苷标准品的保留时间在2.904 min，其他峰为未知样品。样品超声提取后，4 000 r / min离心10 min，取上清液定容至10 mL，经0.22 μm有机滤膜过滤后，取10 μL上样。从图3可以看出，样品中牛蒡苷的保留时间在2.886 min，牛蒡苷的特征吸收波长为280 nm。本试验色谱条件采用武娟霞等[9]的方法进行，在此条件下进行色谱分析，得到牛蒡苷的峰形对称性良好，基线平稳，与杂质峰分离良好，无杂峰干扰，方法可行。

图2 牛蒡苷标准品液相色谱图

图3 样品液相色谱图

2.3 不同粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响

不同粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响见图4。由图4可知，牛蒡苷的提取率呈现先上升后下降的趋势。粉碎粒径为100目时，牛蒡苷的提取率最大，为11.40％。40、60和80目的牛蒡子因为粒径较大，牛蒡苷不易提取完全；牛蒡子粒径过小，表面积增加，可能吸附了一部分牛蒡苷[11]，导致提取率降低，所以选择粉碎粒径为100目。

图4 不同粉碎粒径对牛蒡苷提取率的影响

2.4 不同的溶剂对牛蒡苷提取率的影响

不同的溶剂对牛蒡苷提取率的影响见图5。由图5可知，牛蒡苷的提取率大小为95％乙醇、丙酮、无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯。丙酮、甲醇由于具有一定的毒性，不能作为牛蒡苷提取的溶剂。无水乙醇和95％乙醇下牛蒡苷的提取率均较高，且提取剂安全无毒。牛蒡苷用极性较大的高浓度的乙醇进行提取时提取率较高[9,12]，这与本试验结果相一致。综上，选择95％乙醇作为牛蒡苷提取溶剂。

图5 不同的溶剂对牛蒡苷提取率的影响

2.5 预浸泡时间对牛蒡苷提取率的影响

预浸泡时间对牛蒡苷提取率的影响见图6。由图6可知，预浸泡时间2 h时牛蒡苷的提取率最大，为12.21％。随着时间的延长，牛蒡苷的提取率变化不大。未浸泡的牛蒡子中牛蒡苷提取率较小。适当的浸泡时间能够促使牛蒡苷更多的溶解到提取溶剂中。而浸泡时间过长，牛蒡子中的牛蒡苷提取率与浸泡2 h相比，差异不大。因此，综合考虑能源、效率等因素，选择为预浸泡时间2 h。

图6 预浸泡时间对牛蒡苷提取率的影响

2.6 超声时间对牛蒡苷提取率的影响

超声时间对牛蒡苷提取率的影响见图7。由图7可知，超声时间为35 min时，牛蒡苷的提取率最大，为12.59％。超过35min后，牛蒡苷的提取率下降至8.54％。这是由于超声时间较短，牛蒡苷未被完全提取。超声时间过长，由于超声波的热效应，容易引起部分内酯键的破坏[13]，且能耗增加。所以最佳超声时间为35 min。

图7 超声时间对牛蒡苷提取率的影响

2.7 超声温度对牛蒡苷提取率的影响

超声温度对牛蒡苷提取率的影响见图8。由图8可知，牛蒡苷提取率随温度升高而增加，当温度达到70 ℃时，提取率最大，达到12.61％，80 ℃时提取率下降至11.1％。温度太高，提取溶剂易挥发，降低提取效率，因此选择超声温度为70 ℃。

图8 超声温度对牛蒡苷提取率的影响

2.8 超声功率对牛蒡苷提取率的影响

超声功率对牛蒡苷提取率的影响见图9。由图9可知，超声功率在152 W时，牛蒡苷的提取率达到最大11.66％。随着超声功率增加，牛蒡子中牛蒡苷的提取率有所下降，这可能是因为超声功率过大，热效应增强，牛蒡苷的内酯键易遭破坏[13]，所以最佳超声功率为152 W。

图9 超声功率对牛蒡苷提取率的影响

2.9 料液比对牛蒡苷提取率的影响

料液比对牛蒡苷提取率的影响见图10。由图10可知，随着料液比的增加，牛蒡苷的提取率在料液比1∶150时达到最大值，为10.16％，之后降低。主要是因为前期溶剂量越大，有效成分浸出越完全，提取率也就越大。但当溶剂过大时，超声能量对沉滞在底层的牛蒡子颗粒的机械效应的强度减弱，从而影响超声提取的效果，同时会造成溶剂和能源的浪费，并给后序的浓缩工作带来困难，造成牛蒡苷的提取率减少[13]，所以选择1∶150为最佳料液比。

图10 不同的料液比对牛蒡苷提取率的影响

2.10 正交试验法优化试验

在前期单因素试验结果的基础上，通过正交试验设计优化超声波提取牛蒡苷工艺条件。选择超声温度、功率、料液比和时间4因素做正交试验，结果见表2。由表2中极差分析可知，对牛蒡苷提取率的影响因素从大到小依次为超声温度、料液比、超声功率、超声时间。说明超声温度对牛蒡苷提取率的影响最大，是主要因素。其次是料液比、功率和时间。提取条件的优化组合为A2B1C2D3，最佳提取条件为超声温度70 ℃、超声功率114 W、料液比1∶150（g∶mL）和超声时间45 min。在此提取条件下进行3组平行验证试验，得出平均提取率为12.69％。

表2 4因素3水平正交试验结果

3 讨论与结论

市售牛蒡子质量不一，多含有小石子、土块、残存的叶片等杂质，在试验前必须进行筛选除杂，否则影响牛蒡苷的提取率。本研究在试验前期，对牛蒡子进行水洗、除杂，去除了一些不成熟的牛蒡子和小石子等杂质，确保了试验结果的准确性。采用一定粒度的牛蒡子粉末在超声前进行预浸泡处理，增加了牛蒡子粉末与溶剂的接触时间，浸泡后再进行超声处理，能够显著增加牛蒡苷的提取率。预浸泡不消耗能源，是一种能够有效增加提取物含量的一种处理方式。经过优化处理，牛蒡苷最佳提取工艺条件为提取溶剂为95％乙醇、预浸泡时间2 h、料液比1∶150（g∶mL）、超声时间45 min、超声功率152 W、超声温度70 ℃。在最佳提取条件下进行了3组平行验证试验，得到牛蒡苷的平均提取率为12.69％，高于武娟霞等[9]和吴杨等[10]利用超声工艺提取牛蒡苷提取率。

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Study on the Extraction Conditions of Arctiin in Ultrasonic Method

LIU Chen1a，WANG Ying-chao1b,ConespondingAuthor，JIN Hong1a，MA Xiao-yu1a，SHI Xue-yan1a
（1. Tianjin Agricultural University，a. College of Agronomy and Resource Environment，b. College of Basic Science，Tianjin 300384，China）

The optimal extraction condition of arctiin was studied by ultrasonic method. The newly fresh seed of theArctium lappawas used to investigate the effects of the ultrasonic power, ultrasonic time, ultrasonic temperature, solid-liquid ratio and other factors on the extraction rate of arctiin. Orthogonal experiment was performed to optimize the extraction conditions. The results showed that the crush size was 100 mesh, extraction solvent was 95％ ethanol, pre-soaking time was 2 h, material liquid ratio was 1∶150 (g∶mL), ultrasonic time was 45 min, ultrasonic power was 114 W, ultrasonic temperature was 70 ℃ as the optimum extraction conditions. The three parallel tests were carried out under the optimum extraction conditions, the average extraction rate obtained for arctiin was 12.69％ . Compared with other ultrasonic extraction process, arctiin yield was increased at least 1.89％.

the seeds of theArctium lappa; arctiin; content determination

R284.2

A

1008-5394（2016）04-0028-05

2016-03-11

天津市大学生创新创业训练计划项目“牛蒡子中牛蒡子苷的提取方法比较、优化及其利用”（20151006105）；天津市科技支撑项目“枣活性成分功效研究及产品开发”（11ZCKFNC01600）

刘称（1993-），女，天津市人，本科在读，主要从事生物分离与提取研究。E-mail：376147823@qq.com。

王英超（1981-），女，天津市人，实验师，硕士，主要从事生物化学实验教学与生物分离方面的研究。E-mail：shibiology@163.com。