李冬杰

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018））

植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织诱导、增殖及分化的影响

李冬杰

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018））

为建立黑果枸杞高频再生体系及进行细胞突变体筛选、遗传转化奠定基础，以黑果枸杞叶片、茎段和腋芽为外植体，以MS为基本培养基，附加不同浓度的植物生长调节剂进行愈伤组织的诱导、增殖及不定芽分化研究。结果表明：诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L；在愈伤组织的继代培养过程中，高浓度的2，4-D有利于愈伤组织的诱导，但对愈伤组织的生长有一定的抑制作用，最佳培养基为MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L；在愈伤组织的再分化过程中，6-BA对再生芽的分化效果最好，出芽率高，且多诱导出丛芽，最佳培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L。试验表明：黑果枸杞叶片、茎段和腋芽均可诱导愈伤组织，茎段诱导率最高；筛选出了茎段愈伤组织诱导、增殖及再生芽分化的适宜培养基，为其细胞工程育种及规模化生产提供支撑。

黑果枸杞；植物生长调节剂；愈伤组织；诱导；增殖；不定芽

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属的多年生灌木，药食兼用，为传统珍贵中药材[1]。果实中富含花青素为天然自由基清除剂，能延缓细胞衰老，增强免疫力；具有防治糖尿病、保肝、抗肿瘤、疏通血管、降压、保护心血管等功效[2-3]，药用、生态、经济价值相当可观。市场需求量逐年攀升，野生资源遭受破坏而逐渐枯竭，人工栽培已成为黑果枸杞发展的重要途径。目前，黑果枸杞研究基础薄弱，人工种植存在技术瓶颈。如种源多来源于野生、半野生的采集状态，造成种质不清、优劣混杂现象较为突出[4]，成为制约黑果枸杞质量提高的内在因素。所以优良种苗快繁技术是加快其育种和新品种推广的重要环节[5-6]。有关黑果枸杞快繁技术的报道在逐渐增多[7-9]。本文着重黑果枸杞的高频再生体系研究，探讨不同植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织诱导、增殖及分化的影响，为其细胞工程育种及规模化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为2a生黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr），采自河北科技大学药用植物实验基地。

1.2 方法

1.2.1 愈伤组织的诱导

选取2a生的黑果枸杞茎段、叶片、腋芽为外植体。从试验田取材后，自来水冲洗30min，在超净工作台上用75%的酒精浸润30s，用无菌水冲洗3次。再用0.1%的升汞（HgCl2）消毒，叶片、茎段、腋芽分开消毒，叶片消毒3min，茎段、腋芽消毒5min，然后用无菌水冲洗3次。

在灭过菌的滤纸上把叶片切成0.5cm×0.5cm的方块，茎切成0.5～0.6cm长的茎段，带腋芽的外植体保留1个腋芽，长约为0.5～0.6cm，最后接种于愈伤组织诱导培养基上（见表1）。把叶片、茎段、腋芽平放在培养基上。每种外植体在每种培养基上接10瓶，每瓶接4个外植体。接种后在黑暗条件下培养，定时观察愈伤组织的诱导情况。

表1 愈伤组织诱导、继代培养基

1.2.2 愈伤组织的继代增殖培养

将表1中的培养基作为继代培养的培养基，将诱导的愈伤组织在灭菌的滤纸上切成直径大约为0.3～0.4cm左右的小块，转接到继代培养基上，每种培养基处理10瓶，每瓶接愈伤组织4块。接种后在黑暗条件下继代培养。一段时间后，统计愈伤组织在不同培养基上的生长情况。

1.2.3 愈伤组织的再分化培养

在愈伤组织继代培养后，将分散性较好的愈伤组织转接至分化培养基（见表2）上进行再分化诱导。将愈伤组织在灭菌的滤纸上切成直径大约为0.5cm的愈伤组织块，然后转接到表2所示的再分化诱导培养基上，诱导不定芽或不定根的再生。每种培养基处理10瓶，每瓶接种4块。接种后在光照条件下培养，每天给予光照12～13h，温度控制在25℃。一段时间后，观察愈伤组织的分化情况。

表2 愈伤组织再分化培养基

1.3 数据分析

利用SPSS 20.0软件统计分析数据。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织诱导的影响

在愈伤组织的诱导实验中，采用了8种添加不同植物生长调节剂配比的MS培养基，研究了不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响，结果见表3。外植体接种到愈伤组织诱导培养基上25d后，8种培养基均能诱导出愈伤组织，但是植物生长调节剂的种类、浓度不同对愈伤组织诱导效果不同，诱导率不同，而且愈伤组织的生长情况也不同。A3培养基和A7培养基均对愈伤组织的诱导有很好的效果，愈伤组织块大，颜色淡乳白色，质地较疏松，表面较干爽。比较NAA和2，4-D两种生长素对愈伤组织诱导的效果，2，4-D的效果更好一些，诱导率达到95.8%，出愈时间较早，而且愈伤组织生长速度较大。A1、A2、A5、A6培养基中，外植体上愈伤组织出现较晚，所以愈伤组织块小。A4培养基和A8培养基上出现愈伤组织的时间较早，而且分化率高，但容易褐变，25d时观察，已有部分愈伤组织发生褐变。所以，最佳的愈伤组织诱导培养基为A7培养基，即MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L。

表3 不同植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织诱导的影响

2.2 不同植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织继代增殖的影响

将初代诱导的愈伤组织28d后转接到与初代培养相同的新鲜培养基上，在黑暗条件下进行继代培养（见图1A），转接后的愈伤组织继代培养5d后，愈伤组织块有所增大。12d后愈伤组织的颜色由淡黄绿色转为明亮的乳白色，生长速度明显加快，细胞团快速增大，彼此接触，使愈伤组织块增大1～2.5倍。21d继代1次，如此反复继代3次后，统计试验结果。如表4所示：不同植物生长调节剂对愈伤组织生长的影响和对愈伤组织诱导的影响不相同。高浓度的2，4-D有利于愈伤组织的诱导，但是对愈伤组织的生长有抑制作用。在A2培养基和A6培养基上，愈伤组织生长较快、质地疏松，是较好的分化培养材料。比较这两种培养基，A6培养基对愈伤组织的生长更好一些，长势更快，增殖倍数达到2.5，质地更疏松（图1B）。在A1培养基和A5培养基上的愈伤组织长势较慢，而且质地较致密。在A3、A4、A7、A8培养基上的愈伤组织开始时生长的较快，但是，后来部分出现褐变现象。所以，最佳的愈伤组织继代培养的培养基是A6培养基，即MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L。

表4 不同生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织继代增殖培养的影响

图1 不同生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织继代增殖的影响

2.3 不同植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织再分化的影响

在愈伤组织再分化实验中，采用了由不同生长调节剂配比的9种培养基，进行了不同生长调节剂对诱导愈伤组织再分化影响的试验。将继代后的愈伤组织转接到再分化培养基上后，观察愈伤组织的再分化情况。在刚接入培养基的1～2d内出现水渍化外观，含水量较多，质地松软，3～4d后逐渐变得干燥、致密。愈伤组织在分化培养基上均有不同程度的增殖。7～9d后所有愈伤组织均在愈伤组织块的边缘出现新的浅绿色呈粒状组织区，即为芽点（见图2A）。14d左右愈伤组织表面有小芽萌发现象，在愈伤组织表面见有突起，随着小芽的不断发育，就会形成不定芽（见图2B）。25d时统计实验结果，如表5所示。B5号培养基上最先出现绿色芽点，最先有小芽萌动，分化出丛生芽，诱导率达39.6%。B1、B2、B3、B4培养基上芽的诱导率小，而且诱导的芽一般为单芽，不利于获得大量不定芽。B6号培养基虽然诱导率也较高，而且也能诱导出丛芽。但是，不定芽长势较弱，不利于以后的生根及移栽。

B7、B8、B9添加KT的培养基诱导不定芽的效果总体趋势不如B1、B2、B3、B4、B5、B6添加6-BA的培养基，诱导率低，且诱导出的一般为单芽，不利于得到大量不定芽，而且添加KT培养基上的愈伤组织有不定根的出现，如表5中结果所示。大约2周后B7和B8培养基上的愈伤组织均长出2条不定根，颜色为白色，长度为1cm左右（见图2C）。B1-B6号添加6-BA的培养基中未见有不定根出现，其大部分愈伤组织分化出不定芽。这与一些生长调节剂配比有利于诱导不定芽，而另有一些生长调节剂配比则更有利于不定根的诱导的结果一致[10]。

所以，最佳的不定芽诱导培养基为B5号培养基，即MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L。表明6-BA能够显著促进愈伤组织的再分化，有利于不定芽的发生。但6-BA浓度过高会使芽变得纤细、脆弱，因此在不定芽诱导时宜选用6-BA的浓度为1～2mg/L。为了促进芽的生长，减弱6-BA的顶端抑制作用，在以MS+6-BA 2.0mg/L为基本培养基的基础上，添加一定浓度的NAA。结果表明：NAA能够显著促进芽的伸长，浓度为0.10mg/L效果较好，而高浓度的NAA对愈伤组织出芽的诱导率以及芽的数目有略微的抑制作用。

诱导不定根的最佳培养基为B8培养基，即MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L，表明细胞分裂素KT对愈伤组织再分化出芽的作用不显著，且获得的芽较小，不利于以后的生根和移植培养，但有利于诱导不定根的发生，生根率高，达到53.2%。一定浓度的NAA能促进不定根的生长。

表5 不同植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织再分化的影响

图2 不同植物生长调节剂对黑果枸杞愈伤组织再分化的影响

3 结论

黑果枸杞叶片、茎段和腋芽均可诱导出愈伤组织，茎段诱导率最高。诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L；在愈伤组织的继代培养过程中，所需的条件与愈伤组织诱导的条件不同，高浓度的2，4-D有利于愈伤组织的诱导，但是对愈伤组织的生长有一定的抑制作用，最佳培养基为MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L；在愈伤组织的再分化过程中，6-BA对分化出芽的效果最好，出芽率高，且多诱导出丛芽，最佳培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L。筛选出了茎段愈伤组织诱导、增殖及再生芽分化的适宜培养基，为黑果枸杞抗性细胞突变体筛选、细胞工程遗传育种及规模化生产提供支撑。

［1］韩丽娟，叶英，索有瑞.黑果枸杞资源分布及其经济价值［J］.中国野生植物资源，2014，33（6）：55-57.

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Effects of Plant Growth Regulators on Callus Induction, Proliferation and Differentiation of Lycium ruthenicum Murr.

LI Dong-jie
（Department of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

To establish a high-frequency regeneration system of Lycium ruthenicum Murr.and establish a basis for screening and genetic transformation of cell mutants.Using the leaves，stems and axillary buds of Lycium ruthenicum Murr as ex-plants，MS as the basic medium，the callus induction，proliferation and adventitious bud differentiation were studied when treatment with different concentrations of plant growth regulators.The optimal medium for callus induction was MS+2，4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L.In the process of callus subculture，the high concentration of 2，4-D was beneficial to the callus induction，but inhibited the callus growth，the optimal medium was MS+2，4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L.In the process of callus re-differentiation，6-BA had the best effect on the regeneration buds，the budding rate was high，and the buds were induced by the best culture medium，MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.10mg/L.The leaves，stem and axillary buds of Lycium ruthenicum Murr all could be induced into the callus and the stems had the highest induction rate.The suitable medium for callus induction，proliferation anddifferentiation of stem callus was screened out and which canprovide support for yhe cell engineering breeding and large-scale production of Lycium ruthenicum Murr.

Lycium ruthenicum Murr;Plant growth regulator;Callus;induction;Proliferation;Adventitious bud

S793.95

A

1002-3356（2016）04-0001-05

2016-06-22

项目来源：河北省科技支撑计划（14237503D）。

李冬杰（1966-），硕士，教授，主要从事生物技术方面的教学与科研工作。