杨根梦,陈　逊,曾晓锋

(昆明医科大学法医学院，云南 昆明　650500)



甲基苯丙胺诱导神经细胞自噬的研究进展

杨根梦,陈逊,曾晓锋

(昆明医科大学法医学院，云南 昆明650500)

甲基苯丙胺属于苯丙胺类中枢兴奋剂，是一种以精神依赖为主的新型合成毒品，长期滥用具有很强的神经毒性和药物依赖性。目前其滥用趋势严重，已成为当今全球最严重的公共卫生问题。自噬是广泛存在于真核细胞内的一种利用溶酶体对细胞自身成分进行一系列降解利用的过程。研究表明，甲基苯丙胺可诱导神经细胞自噬，但机制尚未明了。该文主要从甲基苯丙胺诱导神经细胞自噬的机制、信号转导通路及自噬在甲基苯丙胺神经毒性中的作用等方面进行综述，旨在为进一步研究甲基苯丙胺与自噬提供参考。

甲基苯丙胺;自噬;神经毒性;神经细胞;机制;信号通路

甲基苯丙胺(methamphetamine，Meth) 是一种依赖性极高的精神活性物质，俗称“冰毒”，是当今社会最为流行的新型毒品之一。Meth 具有精神依赖性强、复吸率高和神经毒性大等特点，长期大量使用可对神经系统产生明显的毒性作用，并对滥用者身心造成严重损害。此外，由于Meth滥用者共用注射器和不洁性行为可增加感染、传播艾滋病病毒(HIV)的风险，给家庭和社会带来严重的负面影响。自噬(autophagy)是通过溶酶体途径对细胞内受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和侵入其内的病原体进行降解的过程。近年来，众多研究表明，自噬参与了Meth神经毒性的发生发展。本文就Meth与自噬的研究进展进行综述,旨在为进一步研究甲基苯丙胺与自噬和发现新的治疗药物提供指导意义。

1　自噬的基本特点

自噬是除凋亡(Ⅰ型程序性死亡)和坏死外的另一种细胞死亡形式，即Ⅱ型程序性死亡。自噬分为大自噬、小自噬和分子伴侣介导的自噬。通常所讲的自噬是指大自噬，自噬的明显特征是“自噬泡”(AVs)的形成，其是一个连续动态发展的过程。自噬主要通过一系列自噬相关基因(autophagy related genes，Atg)进行严密调控, 其中Atg8在哺乳动物称为LC3，命名为微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain-3，MAPLC3)，LC3包括2种形式，即胞质可溶性形式LC3-Ⅰ和膜结合形式LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬的标志蛋白，可通过检测细胞内LC3-Ⅱ的含量来判断自噬的水平。

2　Meth诱导神经细胞发生自噬

体内实验研究表明[1-3], Meth中毒的大鼠，其中脑N27细胞内自噬泡结构增多并有大量自噬体的存在，随着注射Meth时间的增加，LC3-Ⅱ和Beclin1的表达水平逐渐增高。Larsen等[4]用电镜和自噬免疫荧光分析证实Meth可引起多巴胺神经元内大量自噬泡结构的形成，且自噬泡结构的形成具有时间依赖性。此外，众多研究均证实[5-8]，Meth可诱导SK-N-SH和PC12细胞自噬和促进Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达。综上研究结果表明，Meth可诱导神经细胞自噬。

3　Meth诱导神经细胞自噬的主要信号转导通路

自噬的发生和信号调控机制较为复杂，自噬的诱导由多条信号通路系统控制，Meth诱导自噬的信号转导通路主要包括mTOR、Bcl-2-Beclin1复合物、MAPK介导的信号通路等。

3.1mTOR信号通路对Meth与自噬的调控作用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一个保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，mTOR存在2种形式即mTORC1和mTORC2。mTORC1的主要功能就是调控自噬，其与自噬起始复合物结合抑制自噬。mTORC2与细胞骨架蛋白构建和细胞存活有关。通常所说的mTOR是指mTORC1。Meth引起氧化应激时可产生大量活性氧分子(ROS)，ROS可抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路中的Akt 和mTOR 的活性,从而诱导自噬[1,4,9]。Meth亦可通过抑制Akt /mTOR/p70S6K信号通路来诱导内皮细胞自噬[10]。Kongsuphol等[7]发现Meth能抑制SK-N-SH细胞内mTOR的活性，并通过抑制mTOR信号通路诱导SK-N-SH细胞自噬。Li等[5]和Lin等[3]分别给予PC12和N27细胞不同浓度的Meth,发现随着Meth浓度的增加，磷酸化的mTOR逐渐减少，细胞质内自噬泡结构、LC3-Ⅱ和Beclin1表达水平逐渐增多。Meth诱导自噬时mTOR活性降低可能是与ROS的含量和线粒体功能障碍有关[5]。此外，Meth可增加心肌细胞DDIT4的表达，DDIT4可通过mTOR信号通路调节Meth诱导的自噬与凋亡[11]。 综上研究表明mTOR是Meth诱导自噬的主要负调控因子，Meth可通过抑制mTOR信号通路诱导自噬。

3.2Beclin1/Bcl-2对Meth与自噬的调控作用Beclin 1是哺乳动物的自噬基因，对自噬体的形成至关重要,其水平的升高可以作为自噬诱导的1个指标[10]。Bcl-2是1个抗凋亡蛋白，Bcl-2 通过与Beclin 1结合抑制细胞自噬[11]。Meth可通过Bcl-2-Beclin 1系统来调节自噬。大量研究证实[1,4,12]，Meth引起神经毒性的机制主要是与氧化应激有关。氧化应激过程中可产生大量的ROS。Meth诱导自噬时Beclin1的表达量与ROS相关，细胞内ROS 增加，Beclin-1的表达量上调，进而检测到自噬标志物LC3-II的累积[12]。Meth可通过调节κ阿片受体和激活ERK1/2信号通路来促进Beclin 1的表达，且Meth可促进Bcl-2-Beclin 1复合物的分离而诱导人脐静脉内皮细胞自噬[10]。Meth亦可促使Beclin 1表达升高并促进Beclin 1-Bcl-2分离诱发SK-N-SH细胞自噬。此外，Meth可促进Bcl-2磷酸化而诱导自噬[6]。

3.3MAPK信号通路对Meth与自噬的调控作用MAPK(促分裂原活化蛋白激酶)信号转导途径，包括细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基端激酶(JNK)和p38MAPK等。ERK包括ERK1和ERK2两种形式，Ma等[10]研究发现Meth可通过ERK信号通路促进Beclin 1的表达而诱导内皮细胞自噬，并且Raf-1/MEK1/ERK1/2信号通路亦参与自噬的调节[14]。JNK在自噬过程中主要参与Bcl-2蛋白的转录后修饰。Meth可通过JNK信号通路诱导SK-N-SH细胞自噬。Meth可激活JNK1激酶，JNK1促进Bcl-2磷酸化，Bcl-2的磷酸化可抑制Bcl-2和Beclin1的结合，从而诱导自噬[6]。Song等[15]最近研究表明氧化应激通过激活JNK信号途径参与Meth诱导神经细胞凋亡,而使用VitE对JNK途径进行干预,可降低人SH-SY5Y神经元Meth的神经毒性。

3.4PKCδ对Meth与自噬的调控作用蛋白激酶Cδ(PKCδ)是新型PKC 亚家族中的一个成员, 参与细胞凋亡过程, 它既调节凋亡相关蛋白的功能和表达，自身又是凋亡过程中主要效应蛋白caspase的靶点。近年研究发现, PKCδ参与调节Meth诱导的多巴胺能神经细胞自噬、UPS功能障碍和细胞死亡的过程。Lin等[3]体外研究发现，Meth诱导多巴胺能神经细胞自噬，早期可能是与蛋白酶体功能下降和线粒体膜电位(MMP)消失有关，随后是激活PKCδ引起泛素阳性聚集体增多和LC3-Ⅱ水平的升高。siRNA介导PKCδ表达沉默时，可明显降低Meth诱导的自噬以及泛素阳性聚集体的聚集。因此，Meth可通过激活PKCδ诱导自噬；PKCδ激活被抑制时，LC3-Ⅱ的表达降低而抑制自噬。

3.5自噬的其他调控机制调节自噬的途径还包括泛素蛋白酶体(UPS)系统、p53、p62、Ca离子通道等。Meth诱导神经毒性在功能上可能与UPS功能障碍有关[3]。此外，Meth可破坏BBB从而增加CNS感染HIV的风险，Meth可促进HIV病毒受体和炎症因子的表达而增强HIV对CNS的影响[16]。HIV感染可诱导神经细胞发生凋亡和自噬[17]。李艳明等[18]和Qi等[19]研究发现HIV-Tat蛋白和Meth滥用对Meth诱导神经元凋亡和自噬有着明显的协同作用，但目前协同机制有待进一步研究。

4　自噬在Meth诱导神经毒性中的作用

通常情况下，自噬是细胞对内外环境压力变化的一种适应性反应，在营养剥夺和某种细胞应激条件下，自噬可促进细胞存活；但当自噬被过度激活时，其对细胞有毒性作用并可加重细胞损伤，甚至促进细胞死亡。Meth均可引起神经细胞凋亡和自噬[3]，它们属于不同的程序性细胞死亡方式,从特征上看两者存在一定的差别，但它们并不是完全独立、毫不相关的。在Meth诱导神经细胞毒性时,自噬和凋亡是两个既相互独立又密切联系的过程。

4.1自噬对Meth神经毒性的保护作用研究证实，自噬若适度激活，则可减少蛋白质的聚集和促进细胞存活[20]。通过自噬抑制剂3-MA或由siRNA介导LC3沉默来抑制自噬时，Meth可促进神经细胞凋亡。而LC3短暂性过度表达可减少Meth诱导的细胞凋亡。由于异常折叠蛋白的聚集和细胞器的受损可促进细胞凋亡，而低剂量Meth或Meth诱导的早期自噬可降解异常折叠的蛋白和受损的细胞器而抑制细胞凋亡。因此，低剂量Meth诱导的自噬可作为一种适应性策略对Meth神经毒性具有保护性作用[3]。Ma等[9]发现Meth诱导的早期自噬对内皮细胞是一种促生存机制，其是通过激活κ阿片受体介导的。此外，通过咖啡因抑制自噬可明显增加SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞的Meth神经毒性，而适度的自噬诱导对Meth神经毒性具有保护作用[21-22]。

4.2自噬加重Meth的神经毒性当自噬过度激活，可加重细胞损伤，甚至促进细胞死亡。研究表明，Meth注射早期引起的自噬可促进细胞生存，但随着Meth注射时间和浓度的增加，Meth诱导的自噬可逐渐演变成细胞凋亡而加重Meth的神经毒性[10]。长时间且高浓度注射Meth可引起自噬的过度激活及蛋白质的过度聚集和线粒体功能障碍。自噬的过度激活可促进自噬性细胞死亡，且当蛋白质聚集超出自噬降解能力时，caspase-3可被激活，导致神经细胞凋亡[3]。此外，自噬可通过调控凋亡、坏死或通过自噬相关蛋白影响细胞的死亡过程。

5　药物对Meth与自噬的调节作用

5.1褪黑素(melatonin)对Meth与自噬的调节作用褪黑素(MT)是一种主要由松果腺合成分泌的激素,具有清除自由基、抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。洪汝涛等[23]研究发现褪黑素对大鼠酒精所致急性肝损伤具有改善作用，其作用机制可能与抗氧化、减少TNF-α和IL-1β的生成有关。近年来，众多研究表明[7,24-25]，褪黑素对Meth诱导的神经毒性具有保护作用。Meth能诱导人SK-N-SH细胞内α-突触核蛋白表达增加、减少酪氨酸羟化酶磷酸化和使JNK1磷酸化而诱导自噬，而褪黑素对上述过程具有抑制作用，表明褪黑素对Meth诱导的自噬和神经毒性具有保护作用[6,26]。研究证实[6]褪黑素可通过mTOR 、Beclin-1或Bcl-2介导的自噬信号通路来抑制细胞自噬过程，从而降低Meth的神经毒性。

5.2NAC(N-乙酰半胱氨酸)对Meth与自噬的调节作用N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一种强有力的抗氧化剂,可提高组织内谷胱甘肽(GSH)含量,增强组织抗自由基及抗毒物损伤能力。Chandramani等[1]研究发现，Meth诱导N27细胞自噬与GSH含量降低有关。而NAC可明显减弱Meth诱导的自噬和GSH的消耗。因此，Meth可通过降低GSH水平诱导自噬，而NAC可提高GSH的水平来抑制Meth引起的自噬。另外, NAC作为有效的多巴胺神经存活因子, 可有效地降低人SK-N-SH细胞的死亡率[15]。宋健文等[15]研究发现NAC可抑制Meth诱导纹状体的氧化应激, 减轻Meth多巴胺能神经毒性。NAC可能是通过清除纹状体ROS, 防止JNK磷酸化同时阻止caspase-3活化，从而减少Meth诱导的神经细胞死亡。

5.32-氨基乙磺酸(Taurine)对Meth与自噬的调节作用2-氨基乙磺酸(牛磺酸)是一种含硫的游离β-氨基酸，它以游离形式存在于人体各种组织内。其前体(如半胱氨酸、亚牛磺酸)具有清除氧自由基,增强机体抗应激能力的功能。牛磺酸在体内外可有效抑制谷氨酸兴奋毒性引起的大鼠神经节细胞损伤及凋亡，并对锰诱导的海马神经元细胞氧化应激损伤具有保护作用[27]。研究表明，牛磺酸可明显减少LC3-Ⅱ的表达从而减弱Meth诱导的自噬[5]。此外，牛磺酸对心肌缺血和脑缺血后神经元凋亡具有保护作用，降低caspase-3 活性，抑制凋亡可能是牛磺酸保护脑和心肌的作用机制之一。

综合上述研究，Meth可诱导神经细胞自噬，而褪黑素、NAC、牛磺酸主要是通过其抗氧化性有效减弱Meth诱导的自噬和多巴胺能神经毒性,表明氧化应激可能是介导Meth多巴胺能神经毒性的主要机制。通过对褪黑素、NAC、牛磺酸作用机制的深入研究可能为Meth进一步的防治提供新的策略。

6　小结与展望

Meth的滥用可诱导神经细胞自噬，自噬在机体内是一把双刃剑，既有利又有弊。低剂量Meth诱导的自噬可作为一种适应性的策略对机体起到保护性作用，而高剂量Meth诱导的自噬可引起机体发生自噬性细胞死亡从而加重Meth神经毒性。 因此，研究Meth神经毒性与自噬之间的相互作用，确定Meth与自噬之间的调节机制和信号调控通路，有助于针对Meth诱导自噬的关键蛋白和重要信号通路设计并筛选药物，可为Meth依赖者的靶向治疗带来新的策略。目前Meth与自噬的研究已取得一定的进展，但Meth依赖与自噬之间确切的作用机制和信号调控通路仍不清楚，其将会是今后广大学者研究的重点和最终目标。

(致谢：本文在昆明医科大学法医学院法医毒理和病理实验室完成。)

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Research progress of methamphetamine inducing nerve cell′s autophagy

YANG Gen-meng ，CHEN Xun ，ZENG Xiao-feng

(SchoolofForensicMedicine,KunmingMedicalUniversity，Kunming650500，china)

Methamphetamine(METH), a powerful stimulant of amphetamine type in the central nervous system(CNS) ,is a new kind of synthetic drugs mainly in psychological dependence. Long-time abuse will lead to strong neurotoxicity and drug dependence.Recently it has become the abuse problem in public health. Autophagy is a process of degradation and utilization of the cellular components by the lysosome, which widely exists in eukaryotic cells.Many studies show that methamphetamine can iduce autophagy,but the underlying mechanism is not fully understood yet .Therefore,the mechanisms and signaling pathways of autophagy by methamphetamine and the roles of autophagy in methamphetamine induce neurotoxicity are reviewed in this paper, so as to provide reference materials for further research of methamphetamine and autophagy.

methamphetamine; autophagy; neurotoxicity; nerve cell;mechanism; signaling pathway

时间：2016-9-22 11:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160922.1114.006.html

2016-06-03，

2016-08-02

国家自然科学基金项目(No 81560303;81660310)；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项 (No 2013FB127)；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项(No 2016FB129)；云南省重大传染病疫苗研发重点实验室开放研究基金项目(No KF2015-01)

杨根梦(1992-)，女，硕士生，研究方向：毒品滥用机制,E-mail：1223984885@qq.com;

曾晓锋(1977-)，男，博士，副教授，研究方向:毒品滥用机制，通讯作者，E-mail：zxf2004033@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.10.003

A

1001-1978(2016)10-1341-04

R-05；R322.8；R329.24；R749.61；R971.7