庄金秋，梅建国，李 峰，姚春阳，沈志强

(山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

猪巨细胞病毒检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，李 峰，姚春阳，沈志强

(山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600)

猪巨细胞病毒病是危害养猪业的一种重要传染病。文章概述了猪巨细胞病毒（PCMV）实验室检测方法的研究进展。在细胞生物学方面，主要依靠病毒分离培养、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光试验(IFA)等病毒特异性抗原及其抗体的检测等。在分子生物学方面，主要依靠国内外相继建立起的聚合酶链式反应（PCR）、荧光定量PCR、环介导等温扩增（LAMP）和原位杂交（ISH）技术等。介绍和比较了各种方法的优缺点和实用性，为临床科技工作者建立快速、简便、准确、实用的检测方法提供参考。

猪巨细胞病毒；猪包涵体鼻炎；检测；研究进展

猪巨细胞病毒病又称猪包涵体鼻炎（Porcine inclusion-body rhinitis），是由疱疹病毒科β疱疹病毒亚科的猪巨细胞病毒（Porcine cytomegalovirus，PCMV）引起的一种免疫抑制性传染病。主要发生于幼龄仔猪，在易感猪群中可引起胚胎和仔猪死亡，表现发育不良、鼻炎和肺炎等临床症状。成年猪多呈隐性感染，正常情况下不会表现出明显的临床症状，但当机体抵抗力下降、应激、免疫麻痹或免疫抑制，PCMV对机体的致病作用会加剧。PCMV于1955年被英国的Done首次发现，因在患鼻炎的猪鼻甲骨黏膜黏液腺巨细胞中发现有大量嗜碱性核内包涵体，故又被称为包涵体鼻炎［1］。PCMV是继伪狂犬病 毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）之后第2个被发现的猪疱疹病毒［2］。目前PCMV感染已广泛分布于世界各地，我国多地也先后报道了该病的发生。常规饲养条件下大多数猪群PCMV阳性率很高，且大多数为亚临床型或与其他病原如猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等混合感染，大大加剧了患猪的病死率，给养猪业造成了巨大的损失。本病目前尚无特效治疗药物和方法。本文综述了PCMV的实验室检测方法研究进展，以期为疾病的诊断和有效防治提供参考。

1 病毒分离鉴定

1.1 病毒的细胞培养

病毒分离是最基本的方法之一，PCMV体外培养较困难，R．G．Watt等［3］调查了多种组织对这种病毒的易感性，结果发现只有3～5周龄仔猪的肺泡巨噬细胞（PAM）对首次分离和连续传代的病毒高度敏感。G．Plummer等［4］应用建立的猪输卵管类上皮和输卵管类成纤维细胞（PFT-F）培养PCMV，结果表明：两种细胞对病毒均敏感，但后者更敏感。对疑似感染PCMV仔猪，采集其鼻液、鼻腔或喉头等的拭子洗液以及肺、肾、淋巴结等病料，接种于肺泡巨噬细胞或输卵管类成纤维细胞，进行病毒分离，也可以用无菌或SPF猪的肺泡巨噬细胞直接培养分离病毒。接种后3～14 d可看到巨细胞形成和核内包涵体出现。但由于PAM细胞经常受到包括PRRSV在内的病毒污染，故在细胞使用之前要对其进行监测，确保安全可靠、无污染。其他的培养系统包括猪原代睾丸（ST）细胞、猪肾（PK-15）细胞系和猪鼻甲骨黏膜成纤维（PTK75）细胞等都可用以培养分离病毒。这3种细胞被PCMV感染后，直接作带毒培养，病毒可充分增殖，并出现细胞病变（CPE），但在它们未感染病毒的原代细胞中不能培养。有研究表明：十四烷酰佛波醇乙酸酯（TPA）能增强病毒的复制，PCMV感染的细胞可发生细胞肿胀、巨化，达到正常细胞大小的6倍；采用吉姆萨染色，可见细胞核内的嗜碱性包涵体［5］。

1.2 直接电镜观察

取发病猪肺门淋巴结或上呼吸道黏膜制作成组织切片，经磷钨酸负染色后可直接进行电子显微镜观察。根据PCMV感染机体后形成的特征性巨细胞与核内嗜碱性包涵体，可以做出诊断。也可通过电子显微镜观察PCMV感染细胞的细胞核及空泡内典型的、结晶状排列的、带囊膜的病毒粒子来确诊该病。若病变组织冷冻保存，在病毒活性丧失后至少24 h可在这些组织的冰冻切片上用免疫染色法检测到病毒病原。

2 血清学方法

2.1 血清中和试验

血清中和试验（SN）是经典的血清学检测方法。可用已知标准毒株的免疫血清，以标准的病毒培养物为对照，对分离毒株进行中和试验，可对病毒分离物予以鉴定。

2.2 间接免疫荧光试验

间接免疫荧光试验（IFA）是常用的检测PCMV抗体的血清学方法之一。P．R．Rondhuis等［6］使用猪输卵管细胞系（PFT）制备PCMV抗原，建立了检测PCMV抗体的IFA方法。对采集于荷兰各地1 449份临床猪血清和103份SPF猪血清进行检测，结果表明，除SPF猪血清无PCMV抗体外，其他血清中93%都含有PCMV抗体，且与患有萎缩性鼻炎和无萎缩性鼻炎的猪血清PCMV抗体无明显差异，说明PCMV抗体阳性率很高，也说明PCMV多呈隐性感染。日本于1981年对45个都道府县的441例肉猪血清用IFA法做了抗体调查，其中434例（98．4%）为阳性。R．Assaf等［7］同样以全病毒为抗原建立IFA方法，检测56份临床猪血清，并与ELISA方法进行比较，结果显示：30．35%的血清用两种试验方法检测时滴度相同，25．00%血清用间接ELISA方法比IFA法高4个或更高稀释度。用感染的PAM细胞或PFT-F细胞用丙酮固定，然后进行IFA检测，其敏感度比中和试验高8倍以上，而且还可对不同类别的IgG和IgM抗体予以鉴别。商品猪血清的IFA滴度可达1：64～1：128，有时可达到1：1 024。

2.3 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法具有灵敏性高、特异性强的优点，适用于开展大规模的血清流行病学调查。对于PCMV的检测，血清学检测仍然占主导地位。ELISA的包被抗原主要有两种，一种是全病毒颗粒抗原，另一种是通过基因工程获取的重组目的蛋白。Assaf等［7］、T．Tajima等［8］、D．Yoo等［9］先后以PCMV全病毒为抗原，建立了检测PCMV抗体的ELISA方法，用于检测PCMV抗体。这些方法与IFA相比，具有较高的敏感性。但由于PCMV复制能力较弱，病毒滴度低，很难大量增殖并获得病毒，所以使得以全病毒作为包被原的ELISA方法不能被广泛推广应用。近年来随着分子生物学技术的快速发展及对PCMV糖蛋白B（gB）基因研究的进一步深入，有研究者将gB基因与原核或真核表达载体重组进行体外表达。以重组蛋白为抗原，感染PCMV猪的血清为抗体建立ELISA方法，获得了较好的效果。国内李晶等［10］首次截短表达gB蛋白，包被ELISA酶标板后建立了检测PCMV抗体的间接ELISA方法。用该法检测收集于2005—2010年间湖南各地500份猪血清，检测结果显示，PCMV总血清阳性率为96．4%，其中培育猪抗体阳性率最高达到96．67%，说明中国湖南猪群普遍存在PCMV感染。gB主要抗原表位区重组蛋白不与CSFV、PRV、PRRSV、PCV2等猪常见感染病毒发生血清学交叉反应，说明原核表达的gB蛋白具有良好的抗原性。对采自湖南、河南、江西、广东、广西和福建六省的690份猪血清样品进行检测，发现我国不同省份血清样品的整体阳性率为95．21%（657/690），采自从美国进口种猪群的血清样品阳性率为81．25%（26/32），揭示了该病在我国的高流行，也为PCMV的血清流行病学调查奠定了基础。赵锋祥［11］以纯化的重组蛋白GST-gB2作为诊断抗原建立了间接ELISA检测方法，为临床检测PCMV感染提供了新的简便、快捷的方法，同时为检测试剂盒的开发奠定了良好的基础。刘骁［12］对PCMV gB优势抗原表位区进行了原核表达，并将表达的重组蛋白作为包被抗原建立了一种检测PCMV gB抗体的间接阻断ELISA，对四川省11个地区进行了PCMV分子流行病学调查，结果表明该方法具有较好的特异性（98%）和敏感性（97．8%），适用于PCMV抗体的大批量检测，这为新型PCMV ELISA检测试剂盒的研发及PCMV疫苗的评估奠定了基础。朱月华等［13］以重组PCMV gB蛋白为包被抗原，建立了PCMV抗体的间接ELISA检测方法。对江苏省259份仔猪血清样品进行检测，抗体阳性率达56．76%。其所建立的方法具有简单、快速、敏感和特异等优点，为PCMV抗体检测和流行病学调查提供了有效工具。顾伟伟［14］也利用原核表达系统对PCMV gB基因进行了表达，并用纯化的表达蛋白作为包被抗原建立了检测PCMV抗体的间接ELISA。应用ELISA对2009—2011年收集自我国14个地区27个猪场的1 234份血清样本进行PCMV抗体检测。结果显示，样本的PCMV抗体总阳性率为84．28%；猪场阳性率为100%。猪群抗体阳性率随日龄的增长呈逐渐上升趋势，母猪群的PCMV阳性率高达99．46%。血清学检测充分显示我国猪群中PCMV的感染十分普遍。

2.4 免疫组织化学技术

免疫组织化学技术（IHC）是利用抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究方法。IHC具有特异性强、灵敏度高、定位准确和简便快速等优点。近年来，IHC越来越多地应用于兽医领域，对研究许多意义重大的疾病提供了新的方法。IHC试验中，S．Maki等［15］制作了PCMV感染仔猪肾脏病理组织切片，并制备了单克隆抗体，进行PCMV抗原与单克隆抗体的特异性免疫反应后，加入标记有荧光素的二抗与抗原抗体结合物反应，最后通过病理组织切片上荧光标记物的显色对组织细胞内的PCMV进行了定位、定量，在荧光显微镜下可见细胞内的免疫反应产物。结果显示，在存在PCMV包涵体的30份猪肾脏病理组织切片中有21份检测为PCMV抗原阳性，符合率达到70%。IHC检测技术相对于单纯的病理组织切片染色特异性和精确度有所提高，为PCMV感染的检测提供了良好的工具。

3 分子生物学方法

3.1 PCR技术

PCR技术快速、敏感、特异性强，已被广泛应用于PCMV的检测。A．L．Hamel等［16］首次报道了应用PCR检测PCMV，结果显示加拿大PCMV阳性率大于59%。J．F．Fryer等［17］应用定量竞争PCR对不同的猪器官（包括用于异种移植供体）进行了PCMV的检测，可以从每微克DNA中检出低于10至97个基因组拷贝，保证异种器官移植的安全性。C．S．Lee等［18］建立了检测PRV、PCV和PCMV的多重PCR方法，用于避免这三种病毒在异种器官移植时转移入受体，该方法具有较好的敏感性和特异性。国内朱伟等［19］、李晶等［10］和何万平等［20］通过扩增PCMV部分gB基因建立了PCR检测方法，为PCMV遗传变异分析和分子流行病学调查提供了重要材料，也为gB基因的表达和以gB蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法奠定了基础。刘兴彩等［21］以PCMV的DNA聚合酶（DPOL）基因为模板设计引物建立了PCMV的PCR检测方法，对我国11个省市的100份样品进行了检测，阳性率为33．0%。王燕群［22］（2011）也基于PCMV DNA聚合酶基因设计引物，建立了PRV、PCV2、PPV和PCMV的多重套式PCR检测方法，对具有繁殖障碍临床症状的123份猪病料进行检测，结果显示四种病毒感染普遍存在，其中PCMV和PCV2感染严重，阳性率分别为34．1%和32．5%。刘捷等［23］应用PCR方法检测了2009年从江苏、上海、广东等地患病猪群中采集的76份病料，PCMV阳性率为69．7%，说明我国规模猪场存在PCMV普遍感染。刘红亮等［24］应用PCR方法对四川省部分地区（遂宁、乐山、眉山、简阳、雅安和德阳）采集样品进行PCMV和PRRSV检测，研究猪同时感染PCMV和PRRSV的相关性，36份PRRSV阳性病料中，PCMV检出率为63．89%。王慧［25］也建立了PCR方法对PCMV和PRRSV等病毒进行检测，证明其所建立的PCR方法能够用于PCMV的临床检测。刘骁等［26］应用套式PCR方法，对采自四川省11个地市204份血清和组织样品进行了检测，平均阳性率高达81．9%。顾伟伟［14］采用PCR技术，对2006—2010年收集自我国14个地区49个规模化猪场的812份肺组织病料进行了PCMV检测，PCMV阳性率为39．04%，猪场阳性率为97．96%，表明在我国猪群中PCMV感染较为广泛。裴晓萌等［27］利用PCR方法对2011—2012年来自我国中东部地区193个患病猪群的仔猪病料进行了PCMV检测，PCMV阳性率为59．0%，其中江苏、浙江、上海和安徽的PCMV阳性率分别达到61．9%、64．4%、64．3%和66．7%。表明这些地区的PCMV感染率较高，为有效预防和控制PCMV感染提供了理论依据。PCR检测采样方便、快捷、仅需用棉签在鼻孔内刮取少量鼻腔分泌物即可，鼻拭子采样法即可对死亡猪只也可对活体猪只进行，能满足活体抗原检测、日常流行病学预防等实际工作的需要，但PCR检测方法不适宜疾病的大规模普查。

3.2 荧光定量PCR技术

荧光定量PCR与传统的PCR相比，能有效减少试验中的污染，具有检测快速、批量、灵敏度高、特异性强、可以定性和定量检测等优点。J．E．Abrahante等［28］为了验证器官移植中所用器官是否含有PCMV病原，建立了检测PCMV的荧光定量PCR方法，检测12头卫生要求严格供体猪的EMCV、HEV、PCMV和PLHV等病原，结果发现检测猪6/12为PCMV阳性，且周龄越大PCMV越阳。拜廷阳等［29］建立了PCMV的TaqMan荧光定量PCR检测方法，对15份临床疑似PCMV感染的组织病料进行了检测，其中有9份样品为阳性，与常规PCR方法检测的阳性符合率为100%。对PCMV阳性猪的不同内脏器官进行病毒含量比较检测，发现PCMV含量最高为扁桃体，最低的为小肠。表明其所建立的方法可用于临床上PCMV感染猪的确诊和隐性感染猪的早期检测，对PCMV的快速诊断、综合防控及净化等具有重要意义。

3.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（LAMP）技术在灵敏度、特异性、扩增时间、检测范围上都优于常规PCR技术，而且不需要精密仪器，一般用恒温水浴锅就可以在短时间内进行目的片段的扩增，检测成本低于荧光定量PCR，该方法简便快捷，省时省力，是一种适用于基层实验室快速、准确检测PCMV的方法。J．L．Yang等［30］根据PCMV DPOL基因设计及六对特异性引物，对临床表现PCMV症状的病料提取目的基因，通过优化反应条件建立了LAMP方法。结果表明，LAMP具有和PCR—样的敏感性和特异性，适用于大量PCMV样品的快速检测。廖春燕等［31］针对PCMV gB基因建立了LAMP方法，对2013年来自四川省雅安、成都、绵阳、眉山、乐山、德阳、遂宁、资阳等市的136份病料进行了PCMV检测，其中有89份样品为PCMV阳性，PCMV感染率为65．4%。LAMP为临床上PCMV感染猪的检测和确诊提供了有效的方法，对PCMV的快速诊断、综合防控及净化与异种器官移植的选择等均具有重要意义。

3.4 原位杂交技术

原位杂交（ISH）是在己获得的病毒特异片段上标记放射性同位素或生物素作为探针而建立的一种分子杂交方法，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列的有力工具，具有较高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。

S．Maki等［15］为了研究ISH方法是否适用于PCMV的检测，建立了地高辛标记的荧光原位杂交技术（FISH）。采集了34份疑似感染PCMV仔猪的肾脏病理组织，制作成病理组织切片并固定，经过苏木紫-伊红（HE）染色后发现有30份样品肾髓质肾小管上皮细胞和毛细血管内皮细胞的细胞核内出现PCMV包涵体。FISH检测这30份已知PCMV阳性样本，阳性率为93．3%。在HE检测阳性但ISH检测阴性的2份样品中，HE染色后只见到少量包涵体，但是用ISH检测则没有检测到或者检测到少量包涵体。但是与IHC比较，ISH的敏感性相对较高。该法实现了对PCMV精确定量、定位的检测，发现PCMV主要存在于巨细胞的细胞核与细胞质内。

4 小结

目前我国PCMV常以隐形感染的形式在猪群中广泛存在。在良好的饲养管理条件下，PCMV的地方流行对猪群并不造成严重损失，但当引入新猪群时，因在循环抗体存在的条件下激发潜伏感染，或在易感猪群中引入原发性感染，对猪场构成很大的威胁。另外，随着人类使用猪的活体器官、组织和细胞进行人体器官移植增加，对PCMV的研究和关注也越来越深入［32］：因此，建立PCMV的快速诊断对该病的早期诊断、防治及公共卫生等具有重要意义。国外主要采用加强监测，淘汰持续感染和免疫耐受动物来净化猪群。对我国来说建立、健全并完善PCMV监测系统，尤其是建立对畜群PCMV隐形感染检测的定期监测制度显得尤为重要。传统的病毒分离方法需进行体外细胞培养增殖并观察CPE，但由于PCMV在体外增殖较困难，所需时间长，费时费力，难以推广应用。上述PCMV的血清学和分子生物学检测方法各有优点和缺点，需要根据不同的场合、条件等选择使用其中的一种或者多种方法。虽然上述检测方法为PCMV的检测提供了有效的技术手段，但是随着人们对PCMV深入研究，相信现有的检测方法将不断的得到改进或者新的检测方法将很快研制出来，以使其检测技术更简便化、快速化和准确化，也将对疾病的有效防控产品及技术的研制奠定基础。

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2015-06-15）

山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-06-022-15）

庄金秋（1978-），女，山东潍坊人，兽医硕士，副研究员，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制，

E-mail：zhuangjinqiu2003@163.com