王　青，　张　云,　 毛红娇，　王金萍，　贾如如，　金丽芳，　戴智睿

(绍兴文理学院医学院，浙江 绍兴 312000)



蛇床子素对TCP颗粒诱导小鼠颅骨溶解的影响*

王青，张云△, 毛红娇，王金萍，贾如如，金丽芳，戴智睿

(绍兴文理学院医学院，浙江 绍兴 312000)

[摘要]目的： 观察蛇床子素对磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)颗粒诱导小鼠颅骨溶解的影响。方法: 采用TCP颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型，于术后第2天颅顶局部注射蛇床子素(osthole)20 mg/kg，每周3次，持续干预2周。干预结束后处死动物取材，应用HE染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP)染色观察假体周围破骨细胞生成和骨溶解程度；ELISA法检测血清和骨组织中骨转换标志物骨钙素(osteocalcin)水平、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和TRACP活性以及骨膜中肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)水平。Western blot法检测颅骨组织葡萄糖调节蛋白 78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和CAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CAAT/ enhancer binding protein homologous protein，CHOP)的表达变化。结果: 蛇床子素可明显抑制TCP颗粒诱导的破骨细胞生成，减少骨溶解面积，显著增加ALP和osteoclacin水平，降低TRAP活性并阻断炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β释放。此外，蛇床子素干预能明显减弱TCP颗粒激活的内质网应激反应。结论: 蛇床子素可抑制TCP颗粒诱导的小鼠颅骨溶解，其机制可能与抑制TCP颗粒诱导的内质网应激反应有关。

[关键词]磷酸三钙颗粒； 破骨细胞； 骨溶解； 蛇床子素； 内质网应激

新近假体翻修术回顾性研究发现聚乙烯、陶瓷和金属类等3类松动假体周围聚集大量的磨损颗粒，这些颗粒可趋化并激活假体周围单核/巨噬细胞、成纤维细胞和成骨细胞，使其大量增殖并分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)等因子[1]；这些炎症因子可直接或间接诱导破骨细胞分化、活化，最终导致假体周围骨溶解和假体松动[2]。因此，磨损颗粒诱导假体周围骨溶解是人工关节无菌性松动和关节翻修的主要原因之一。

由于翻修术治疗假体松动其疗效低于初次手术，手术创伤大、价格昂贵等原因，目前临床上多使用双膦酸盐抑制假体周围骨溶解，但是这类药物中远期疗效欠佳，而且容易诱发骨坏死及心房纤维性颤动[3]。此外，目前也有学者尝试通过基因疗法治疗假体周围骨溶解并取得一定的效果，然而基因治疗在国内外均处于起步阶段，存在影响范围大、毒副作用不清楚等风险[4]。因此，利用中药现代化技术从天然药用植物中寻找新的高效、低毒药物抑制假体周围骨溶解十分必要。

蛇床子素(osthole)又名甲氧基-8-异戊烯基香豆素，是最先从伞形科植物蛇床中分离出的天然香豆素类化合物。有研究证实蛇床子素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病和神经保护等作用。近年有研究表明蛇床子素具有雌激素样作用，能明显抑制大鼠去卵巢诱导的高骨转换，可减少骨丢失和治疗骨质疏松[5-6]。此外，蛇床子素还具有促进成骨细胞的增殖、增强碱性磷酸酶(alkaline-phosphatase, ALP)活性和增加胶原合成等作用[7]；但是对于蛇床子素能否影响磨损颗粒诱导假体周围骨溶解和抑制骨吸收，目前还没有相关文献报道。因此，本研究应用小鼠颅骨溶解模型研究蛇床子素对磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)颗粒诱导假体周围骨溶解的影响，并探讨其可能作用机理，为临床应用蛇床子素防治假体周围骨溶解和关节松动提供实验基础。

材料和方法

1动物

6周龄ICR雄性小鼠36只，体重18～22 g，由浙江省军事医学科学院实验动物中心提供,许可证号为SCXK(浙)2011-0015，合格证号为4402101912。实验前将动物置室内适应性饲养3 d，温度22～28 ℃，相对湿度50%～70%。

2主要试剂

TCP颗粒由浙江大学化学系馈赠；蛇床子素(纯度≥99.8%)购自上海源叶生物技术有限公司；鲎试剂购自上海吴昊经贸有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRACP)染色试剂盒购自Sigma；ALP 活性检测试剂盒、TRACP活性检测试剂盒、RIPA裂解液和ECL显色液购自上海碧云天生物技术研究所；骨钙素ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司；兔源性葡萄糖调节蛋白 78(glucose-regulated protein 78，GRP78)抗体、兔源性CCAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)抗体和小鼠β-actin抗体购自CST；PVDF膜购自Millipore。

3主要方法

3.1TCP颗粒的准备TCP颗粒经电镜扫描显示TCP颗粒平均粒径为1.997 μm，其中90%的颗粒小于3.2 μm，颗粒容易发生聚集(图1)。将TCP颗粒置于70%乙醇溶液，室温振荡浸泡48 h后去除乙醇。再经无水乙醇浸泡，沉淀48 h后去除乙醇，干燥后取30 mg用玻璃纸分装，将颗粒置于250 ℃恒温箱中3 h。采用鲎试剂法检测TCP颗粒表面内毒素含量小于0.25 Eu·mg-1·mL-1。表明该颗粒表面内毒素低于该试剂盒的最低检测线，排除内毒素污染。

Figure 1.SEM image of the TCP particles.

图1TCP颗粒扫描电镜图

3.2小鼠颅骨溶解模型的建立用乙醚麻醉小鼠，无菌条件下取颅顶正中矢状切口，长约0.8 cm。分离皮下组织，显露出1 cm×1 cm颅骨区域。其中假手术(sham)组进行原位缝合，其余组取TCP颗粒30 mg置于颅顶后缝合皮肤。蛇床子素组小鼠于术后第2天颅顶局部注射蛇床子素(20 mg/kg)，每周3次，持续干预2周。假手术组小鼠颅顶局部注射生理盐水，注射时间与蛇床子素一致。干预结束后各组小鼠通过摘除眼球取血，用于血清骨转换标志物和炎症因子检测；同时取出颅骨(以正中矢状线为中心的方形区域)，PBS清洗后称颅骨湿重，取颅骨骨膜检测炎症因子，再提取骨组织分析破骨细胞形成、骨溶解以及内质网应激通路蛋白的表达。

3.3HE染色颅骨经4%多聚甲醛固定24 h和10% EDTA(pH 7.4)脱钙2周后，石蜡包埋、切片，厚度为7 μm。HE染色后置于IX70显微镜观察。利用Image-Pro Plus 5.0(Media Cybernetics)计算正中矢状缝区域三核及以上破骨细胞数。

3.4TRACP染色颅骨经4%多聚甲醛固定10 min，0.25 mol/L氢氧化铵超声清洗5 min。系列乙醇脱水(50%、80%、90%、100%)后自然晾干，加入TRACP 37 ℃避光染色60 min。蒸馏水清洗后，置于IX70显微镜下观察。

3.5血清骨转换标志物与炎症因子释放的检测小鼠，血液置于4 ℃冰箱放置30 min，1 500 r/min离心10 min取上层血清。采用ALP、TRACP和骨钙素试剂盒检测血清中上述骨转换标志物的变化。

取颅骨骨膜，剪碎后加入200 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min。经12 000 r/min离心 15 min后收集上清，分别用TNF-α、IL-1β和IL-6等ELISA试剂盒测定骨膜中上述炎症因子的变化。

3.6骨组织蛋白提取与ALP和TRACP活性测定每组各取3只小鼠颅骨，剪成1 mm×1 mm× 1 mm碎片；加入液氮研磨成粉末后加入800 μL RIPA裂解液冰上裂解30 min。12 000 r/min离心 15 min后收集上清液，BCATM试剂盒检测各组蛋白浓度。分别采用ALP和TRACP等试剂盒测定颅骨组织ALP和TRACP的活性。

3.7Western blot实验颅骨组织蛋白加入上样缓冲液煮沸10 min，冷却后每孔上样30 μg，进行12% SDS-PAGE分离蛋白，电泳完成后将蛋白转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶常温封闭2 h，分别加入兔源性I抗CHOP(1∶1 000)、GRP78(1∶1 000)及β-actin(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗涤3次后加入HRP标记的 II 抗室温孵育2 h，TBST清洗3次加入ECL显色；通过凝胶成像系统扫描分析各蛋白变化。

4统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1蛇床子素对小鼠体重和颅骨湿重的影响

从表1可以看出，实验开始至结束，假手术组、TCP颗粒组、蛇床子素组(20 mg/kg)小鼠体重均相似，无显著差异，表明蛇床子素对小鼠体重无明显影响。同时还发现TCP颗粒组颅骨湿重明显低于假手术组(P<0.05)，而蛇床子素组小鼠颅骨湿重大于TCP颗粒组(P<0.05)，提示蛇床子素显著抑制TCP颗粒诱导的小鼠颅骨丢失。

表1蛇床子素对小鼠体重和颅骨湿重的影响

Table 1.The effects of osthole on body weight and calvaria weight (Mean±SD.n=3)

GroupBodyweight(g)StartingFinalCalvariaweight(mg)Sham22.6±1.636.1±3.689.6±5.1TCP23.1±2.735.2±2.165.1±2.6*Osthole22.4±2.135.6±1.880.8±4.1#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

2蛇床子素对TCP颗粒诱导小鼠颅骨溶解的影响

HE和TRACP染色结果表明假手术组破骨细胞数较少、骨溶解面积较小。TCP颗粒植入后可诱导大量破骨细胞生成和大面积骨溶解，破骨细胞数和骨溶解面积增加，分别为假手术组的6.22倍和8.87倍(P<0.05)。结合颅骨湿重结果，提示TCP颗粒可诱导小鼠颅骨溶解。而蛇床子素组能显著抑制TCP颗粒诱导的破骨细胞数和骨溶解面积(P<0.05)，见图2、3。

3蛇床子素对骨转换标志物和炎症因子释放的影响

ALP和骨钙素分别为成骨细胞早期分化和成熟的标志；TRACP为破骨细胞特征酶，因此，ALP、骨钙素和TRAP被认定为是骨转换标志物[8]。为观察蛇床子素对上述骨转换标志物的影响，本研究应用ALP、骨钙素和TRAP试剂盒分别检测蛇床子素处理后血清和骨组织中这些指标的变化。血清学结果显示TCP组小鼠血清ALP活性和骨钙素水平明显降低，而TRACP活性显著增加，ALP活性和骨钙素分别为假手术组的73.24%和8.39%，TRACP活性为假手术组的3.79倍。蛇床子素干预能提高血清ALP活性和骨钙素水平(P<0.05)，同时显著抑制血清TRACP活性(P<0.05)。另外，TCP颗粒植入后颅骨组织中ALP活性显著降低且TRACP活性显著升高，与血清学检测结果一致。而蛇床子素干预后骨组织中ALP活性升高，TRAP活性降低(P<0.05)，见表2。

Figure 2.The effects of osthole on TCP particles-induced osteoclastogenesisinvivo(HE staining). Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

图2蛇床子素对TCP颗粒诱导假体周围破骨细胞生成的影响

Figure 3.The effects of osthole on TCP particles-induced osteolysis in the mouse calvaria (TRACP staining). Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

图3蛇床子素对TCP颗粒诱导假体周围骨溶解的影响

表2蛇床子素对骨转化标志物的影响

Table 2.The effects of osthole on the level of bone turnover markers (Mean±SD.n=3)

IndexShamTCPOstholeSerumlevelALP(U/L)71.40±16.0052.30±11.40*65.10±19.10*#Osteocalcin(μg/L)8.46±0.590.71±0.03*2.26±0.90*#TRAP(U/L)1.71±0.326.48±0.84*2.36±0.55*#CalvariaALPactivity(U/g)11.70±0.346.69±0.76*9.45±0.91*#TRAPactivity(U/g)0.57±0.071.12±0.06*0.66±0.09#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

另外，本研究通过ELISA法检测骨膜TNF-α、IL-6和IL-1β水平，观察炎症因子在蛇床子素抑制磨损颗粒诱导骨溶解中的作用。如表3所示，TCP颗粒组小鼠颅骨骨膜中TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显升高，分别增加为假手术组的4.92倍、10.18倍和17.38倍(P<0.05)，表明TCP颗粒可诱导假体周围细胞释放炎症因子，促进破骨细胞的分化、活化和骨吸收[3]。蛇床子素干预能抑制上述炎症因子释放，其骨膜中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著减少，仅为TCP颗粒组的37.82%、23.24%和22.96%(P<0.05)。

表3蛇床子素对TCP颗粒诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6释放的影响

Table 3.The effects of osthole on TCP particles-induced the release of TNF-α, IL-1β and IL-6 in the periosteum (ng/L. Mean±SD.n=3)

GroupTNF-αIL-6IL-1βSham72.34±4.3243.60±2.2215.91±1.21TCP356.17±2.14*443.97±5.16*276.54±5.17*Osthole134.71±0.91*#103.19±6.98*#63.49±3.43*#

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

4蛇床子素对TCP颗粒诱导的内质网应激反应的影响

有研究证实TNF-α、IL-6和IL-1β等炎症因子不仅在假体周围破骨细胞和骨溶解中发挥重要作用，还可诱导内质网应激和UPR通路激活[9-10]，参与调控炎症性骨溶解疾病的发生和发展[11]。为探讨内质网应激信号通路是否参与蛇床子素抑制TCP颗粒诱导的炎症性骨溶解，本研究应用分子免疫印迹方法检测骨组织内质网应激反应标志蛋白GRP78和CHOP的表达变化。实验结果表明，TCP颗粒可诱导内质网应激反应，表现为内质网应激通路蛋白GRP78和CHOP表达增加，分别为假手术组的14.31倍和2.40倍(P<0.05)。而蛇床子素处理后GRP78和CHOP表达为TCP颗粒组的42.87%和33.99%，其中蛇床子素对CHOP抑制作用更明显(P<0.05)，提示内质网应激信号通路可能参与蛇床子素抑制TCP颗粒诱导的小鼠颅骨溶解，见图4。

Figure 4.The effects of osthole on TCP particles-induced ER stress response. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsTCP group.

图4蛇床子素对TCP颗粒诱导的内质网应激反应的影响

讨论

人工关节置换术常用于治疗严重关节疾病，然而假体周围骨溶解和关节松动常常会导致关节置换失败和关节二次翻修。因此，如何通过抑制磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解，防治假体松动已经成为目前人工关节发展的重要课题。本研究证实蛇床子素可抑制假体周围破骨细胞活化和功能，阻断小鼠颅骨溶解，其机制可能与阻断TCP颗粒诱导的内质网应激反应密切相关。

蛇床子素是从伞形科植物蛇床成熟果实蛇床子中提取的香豆素类化合物，具有抗心律失常、抗氧化、抗炎、抗过敏、抗肿瘤和抗细胞凋亡等多种生物活性。另有研究认为蛇床子素可促进成骨细胞增殖、分化，抑制破骨细胞形成而发挥抗骨质疏松作用。但是蛇床子素是否对磨损颗粒诱导的炎症性骨吸收有影响？目前还没有相关文献报道。本研究应用TCP颗粒诱导小鼠颅骨溶解模型，观察蛇床子素对TCP颗粒诱导的假体周围骨溶解的影响。结果显示20 mg/kg蛇床子素可明显抑制假体周围破骨细胞生成，阻断TCP颗粒诱导的小鼠颅骨溶解，同时伴随骨转换标志物ALP活性和osteocalcin水平的明显升高及TRACP活性的显著降低。

聚乙烯、金属和陶瓷颗粒可刺激假体周围单核/巨噬细胞、成纤维细胞和成骨细胞等组织细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，这些炎症因子可促进破骨细胞活化并诱导骨溶解，提示炎症因子在磨损颗粒诱导假体周围骨溶解中发挥重要的作用，可作为假体周围骨溶解和人工关节松动的治疗靶点。我们采用ELISA检测到TCP颗粒可诱导TNF-α和IL-1β释放，增加骨膜中TNF-α和IL-1β水平，与Ding等[12]研究结果基本一致。另外，我们还观察到TCP颗粒组小鼠骨膜中IL-6水平显著增加，表明TCP颗粒可诱导IL-6的释放，而Ding等[12]和Obando-Pereda等[13]却认为氧化锆陶瓷颗粒不能刺激体外培养的巨噬细胞产生IL-6，其原因尚需进行更深入的研究论证。同时，本研究还发现蛇床子素干预可显著抑制TCP颗粒诱导的炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β产生，导致小鼠骨膜中TNF-α和IL-6水平分别减少为TCP颗粒组的37.82%、23.24%和22.96%，阻断破骨细胞生成和假体周围骨溶解。结合表2数据，我们发现蛇床子素抑制TCP颗粒诱导炎症因子的释放比其对骨转换标志物的影响更明显。由此推测，抑制假体周围炎症因子的释放是蛇床子素阻止TCP颗粒诱导假体周围破骨细胞形成和骨溶解的机制之一。但是其发挥治疗作用具体机制尚不清楚。

最近有研究显示炎症因子不仅可诱导假体周围破骨细胞的生成和骨吸收，而且还能激活内质网应激和引起未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)[8-9]。例如，Brozzi等[14]研究发现在1型糖尿病中，炎症因子IL-1β和IFN-γ可通过激活内质网应激信号通路，诱导胰岛β细胞凋亡。本研究结果证实TCP颗粒植入小鼠颅骨后可上调内质网应激通路标志蛋白GRP78和CHOP的表达，诱导内质网应激反应。另外，Wang等[11]也报道：内质网应激的抑制剂4-PBA可明显阻断TiPs/CoPs 颗粒诱导巨噬细胞释放TNF-α和IL-6，造成破骨细胞生成和骨溶解减少。以往研究和本实验结果表明：内质网应激可能参与磨损颗粒诱导假体周围炎症介质的释放、破骨细胞生成和骨溶解。蛇床子素干预明显抑制TCP颗粒诱导的内质网应激反应，减少GRP78和CHOP表达，提示蛇床子素抑制TCP颗粒诱导假体周围骨溶解可能是通过调控内质网应激反应而实现的。

综上所述，蛇床子素可抑制TCP颗粒诱导的小鼠颅骨溶解，有望成为治疗和预防磨损颗粒诱导骨溶解的候选药物，减少TCP磨损颗粒所致的骨溶解和关节松动的发生。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

*[基金项目]国家自然科学基金资助项目(No.81200606);广东省科技计划(No.2012B031800313);广东省自然科学基金资助项目(No.2015A030313458);广州市属高校科技计划(No.1201410467);广州市科技计划(No.201510010201)

Effect of osthole on tricalcium phosphate particles-induced calvarial osteolysis in a mouse modelWANG Qing, ZHANG Yun, MAO Hong-jiao, WANG Jin-ping, JIA Ru-ru, JIN Li-fang, DAI Zhi-rui

(CollegeofMedicine,ShaoxingUniversity,Shaoxing312000,China.E-mail:zhangyunbme@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of osthole on tricalcium phosphate (TCP) particles-induced calvarial osteolysis in vivo.METHODS: Male ICR mice were randomly divided into sham group, TCP group and osthole group. A mouse calvarial model of osteolysis was established by TCP particles. On the second postoperative day, osthole (20 mg/kg) was locally injected into the calvarium under the periosteum 3 times a week. Two weeks after osthole treatment, blood and calvaria were collected to determine the level of bone turnover markers such as alkaline phosphatase(ALP), osteocalcin and tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP). The periosteum was performed to examine the release of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and IL-1β by ELISA. The calvaria was obtained for histological and molecular analyses. RESULTS: Data from HE and TRACP staining revealed that osthole prevented TCP particles-induced obvious increase in osteoclastogenesis and resorption area in the metaphysis of mouse calvaria. Osthole treatment increased ALP activity and osteocalcin level, and dncreased the activity of TRACP in the mouse serum compared with TCP group. Furthermore, TCP particles-induced the releases of TNF-α, IL-6 and IL-1β were significantly suppressed by osthole treatment. In addition, Western blot demonstrated that endoplasmic reticulum (ER) stress markers such as glucose-regulated protein 78 (GRP78) and CAAT/enhancer binding protein homologous protein (CHOP) were significantly up-regulated in TCP particles-implanted calvarial mice, indicating that TCP particles triggered an ER stress response in the mouse calvarial osteolysis model, which obviously attenuated by osthole. CONCLUSION: Osthole inhibits TCP particles-induced calvarial osteolysis in mice, which is mediated by inhibition of ER stress signaling pathway.

[KEY WORDS]Tricalcium phosphate particles; Osteoclast; Osteolysis; Osthole; Endoplasmic reticulum stress

通讯作者△Tel: 020-37103213； E-mail: yang-chuntao@163.com

[收稿日期]2015- 09- 03[修回日期] 2015- 10- 20

[文章编号]1000- 4718(2015)12- 2271- 06

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.12.026

[中图分类号]R285.5； R363

[文献标志码]A