缪素娜戴煦徐维嘉

（华测检测认证集团股份有限公司广东深圳518101）

对ISO 4134：1999标准的分析及修订建议

缪素娜戴煦徐维嘉

（华测检测认证集团股份有限公司广东深圳518101）

对肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸含量测定的国家标准和国际标准进行了比较分析，指出国际标准ISO 4134：1999存在明显的技术争议，进而对ISO 4134：1999存在问题与不足进行了深入分析，并提出了一些具体的修订建议，目的在于引起重视和广泛讨论，以促进ISO 4134：1999的尽快修订，提高其适用性。

ISO：1999；L-（+）-谷氨酸；测定；修订；建议

1 前言

L-（+）-谷氨酸含量是肉和肉制品中的重要评价指标之一[1]，L-（+）-谷氨酸在肉和肉制品中以自由流动的游离态和构成蛋白质结构的结合态两种形式存在，其中游离态L-（+）-谷氨酸主要作为鲜味风味前体物评价指标之一[2-7]，结合态L-（+）-谷氨酸主要作为蛋白质营养价值评价指标之一[7]，两者在肉和肉制品中的含量差别可达上百倍[7]，测定两者具有不同的指导意义。目前国内没有专门针对肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸测定的标准，其中国家标准GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》[8]能满足肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸的测定，其所测得的L-（+）-谷氨酸为总L-（+）-谷氨酸（游离态和结合态的总和）。国际标准ISO 4134：1999《肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸的测定参考法》[9]是专门针对肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸含量测定的标准，其检测原理是采用0℃的高氯酸溶液对试样中的L-（+）-谷氨酸进行提取，氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）在谷氨酸脱氢酶（GIDH）存在的条件下被L-（+）-谷氨酸还原，得到的还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在心肌黄酶的作用下与碘四唑硝基氯（INT）反应生成甲瓒，用分光光度计在492 nm处测定甲瓒的吸收峰，从而计算L-（+）-谷氨酸含量。从ISO 4134：1999检测原理看，其所测得的L-（+）-谷氨酸为游离态L-（+）-谷氨酸，但标准中未对其进行明确界定和说明，容易误导标准使用者以为所测得的为总L-（+）-谷氨酸，从而觉得同一样品采用国家标准GB/T 5009.124-2003和国际标准ISO 4134：1999所测得的L-（+）-谷氨酸结果相差甚远，轻者造成困惑，甚者引起检测纠纷或带来经济损失。因此笔者认为有必要对ISO 4134：1999标准进行深入分析，并提出具体的修订建议。

2 ISO 4134：1999标准存在问题与不足

通过对ISO 4134：1999标准条文进行解读分析，并结合笔者多年研究经验，认为其存在以下问题与不足。

2.1 存在问题

（1）L-（+）-谷氨酸在肉和肉制品中分别以自由流动的游离态和构成蛋白质结构的结合态两种形式存在，而标准中“9.2样品前处理”关于L-（+）-谷氨酸提取过程，主要是将试样用绞肉机绞烂后，取约50 g加入100 mL 0℃稀高氯酸溶液（1 mol/L）进行均质，均质后离心过滤取滤液。由此可见该提取过程并没有将构成蛋白质结构的结合态L-（+）-谷氨酸水解释放出来，也就是滤液中被检测的L-（+）-谷氨酸实质上仅为游离L-（+）-谷氨酸，笔者也通过试验证实了这一个观点。但标准文本并未对此进行明确界定和说明，容易误导标准使用者。

（2）标准中5.7的心肌黄酶检测溶液和5.9的谷氨酸脱氢酶溶液均以mg/mL为单位，但未标识相应的酶活力单位。由于酶活力单位是酶制剂最关键的指标，该指标的缺失，会使标准使用者在选购和配制试剂时无可适从，从而导致检测无法开展或检测失败。

（3）根据ISO 1442：1997《肉和肉制品水分含量测定》[10]，Wm（水分含量）是以质量分数（百分比）表示，从附录C关于L-（+）-谷氨酸含量计算公式由来的推导看，10.3试样L-（+）-谷氨酸的含量计算公式中的“Wm/100”不正确，应去掉“/100”；另从附录C关于计算公式由来的推导看，Wg实际指的是试样（包括水分）的L-（+）-谷氨酸含量，因此公式下方的符号说明“Wg是指试样干基L-（+）-谷氨酸含量”的说法有误，应去掉“干基”。

2.2 不足

（1）9.3的“绘制吸光值随时间变化的曲线，将曲线反向延长与纵坐标交汇，推算反应开始时吸光值（参见附录B）”的做法不科学。用曲线外推法寻找反应起始值适用于随着反应时间延长反应产物检测结果稳步增长且没有反应终点的运算[11]，而事实上标准中的检测试剂是过量的，随着L-（+）-谷氨酸消耗完毕，反应产物的吸光值则不再增大，因此正确的做法应以反应产物吸光值的稳定值作为反应终点，并以反应终点的吸光值作为检测结果。尽管L-（+）-谷氨酸标准溶液和试样检测溶液均采用外推法推算反应开始时吸光值作为检测结果，与均采用反应终点吸光值作为检测结果运算得到的L-（+）-谷氨酸含量大体上一致，但采用外推法推算反应开始时吸光值得到的间接检测结果肯定不如直接测得的反应终点检测结果真实可靠，具有造成检测结果误差增大的风险。

（2）标准中采用已知浓度的L-（+）-谷氨酸标准溶液（0.02 mg/mL）所对应的吸光值差来对反应产物甲瓒的摩尔吸光系数[12]进行单点校正，然后根据甲瓒的摩尔吸光系数和试样检测溶液的吸光值差、稀释倍数计算试样L-（+）-谷氨酸含量。当试样检测溶液L-（+）-谷氨酸浓度与L-（+）-谷氨酸标准溶液（0.02 mg/mL）相差较大时，容易造成检测结果偏差较大，因此采用单点校正存在局限。

（3）反应产物甲瓒由分光光度计进行测定，每个样品测定均需人手单独操作，终点判定需每隔2 min重复读数直到读数稳定为止，操作繁琐、检测效率低。

3 ISO 4134：1999标准修订建议

针对上述存在问题与不足，笔者提出如下修订意见：

（1）针对问题1：对标准测定的L-（+）-谷氨酸进行明确界定，并将标准的测定对象从仅为肉和肉制品中游离L-（+）-谷氨酸，扩大到肉和肉制品中游离L-（+）-谷氨酸和总L-（+）-谷氨酸。相应地，在术语定义增加游离L-（+）-谷氨酸和总L-（+）-谷氨酸的术语解释；在检测步骤里增加试样总L-（+）-谷氨酸的提取；在吸光值测定里增加试样检测溶液总L-（+）-谷氨酸的吸光值测定；在结果计算和公式由来的推导里增加试样总L-（+）-谷氨酸的计算公式及公式由来的推导。

（2）针对问题2：补充心肌黄酶检测溶液和谷氨酸脱氢酶溶液对应酶活力单位的标识。

（3）针对问题3：将计算公式中的“Wm/100”更正为“Wm”。将计算公式下方的符号说明“Wg是指试样干基L-（+）-谷氨酸含量”更正为的“W1是指试样游离L-（+）-谷氨酸含量”。

（4）针对不足1：将“绘制吸光值随时间变化的曲线，将曲线反向延长与纵坐标交汇，推算反应开始时吸光值（参见附录B）”修改为“以吸光值稳定值做为反应终点检测结果”，并相应地将附录B删去。

（5）针对不足2：将L-（+）-谷氨酸标准溶液（0.02 mg/mL）更改为L-（+）-谷氨酸标准系列溶液（0.006 g/L、0.010 g/L、0.020 g/L、0.040 g/L、0.060 g/L），对L-（+）-谷氨酸标准系列溶液进行吸光值测定，建立L-（+）-谷氨酸溶液标准曲线和数学方程，代替L-（+）-谷氨酸标准溶液单点校正。

（6）针对不足3：光吸收酶标仪与分光光度计测定反应产物吸光值的原理相似，理论上采用分光光度计的测定均可用光吸收酶标仪代替，且光吸收酶标仪具有分光光度计难以比拟的优势：光吸收酶标仪为仪器自动检测，能对反应过程进行在线实时监控，可生成吸光值随反应时间变化的动力学曲线，使检测过程一目了然并能自动识别反应终点；光吸收酶标仪最常用的反应载体为96孔板，也就是一批次能检测多达96个样品，具有高通量快速并大量节省试剂成本的特点。因此提出在标准中新增一种测定L-（+）-谷氨酸的检测方法——光吸收酶标仪法。将标准的原检测方法（分光光度计法）分类为第一法，将新增方法分类为第二法。第二法继续沿用第一法的适用范围、规范性引用文件、术语定义、原理、抽样、试样制备及检测步骤的样品前处理章节内容，在参照第一法的基础上，对试剂、设备、检测步骤的吸光值测定、结果计算与表达及公式由来的推导进行修改和补充。

4 结语

本文通过对肉和肉制品中L-（+）-谷氨酸测定的国家标准GB/T 5009.124-2003和国际标准ISO 4134：1999进行对比分析，认为ISO 4134：1999存在明显的技术争议，进而对ISO 4134：1999进行了深入分析，并针对ISO 4134：1999存在问题与不足提出了一些具体的修订建议。这些修订建议还有待于进行深入的试验论证，以为ISO 4134：1999的修订提供更为可靠的数据支撑。

由于理解角度和能力的限制，上述的分析及修订建议难免偏颇，诚请专家、学者们批准指正。

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Analysis and Revision Suggestions on ISO 4134：1999

MIAO Suna，DAI Xu，XU Weijia
（Centre Testing International（Shenzhen）Ltd.，Shenzhen，Guangdong，518101）

This paper gives a comparative analysis on the national and international standards of meat and meat products determination of L-glutamic acid content，and points out that the international standard ISO 4134：1999 has obvious technical disputes，then makes a in-depth analysis on the existing problems and shortcomings of ISO 4134：1999，and puts forward some concrete revision suggestions，in order to arouse attention and extensive discussion for the current standard，to promote its revision and improve its applicability.

ISO：1999；L-（+）-Glutamic Acid；Determination；Revision；Suggestions

TS207

E-mail：miaosuna@cti-cert.com

2016-06-17