辛宝林 于秀坤

（大庆市疾病预防控制中心，黑龙江 大庆 163311）

两种结核病病原菌快速检测技术的效果比较

辛宝林 于秀坤

（大庆市疾病预防控制中心，黑龙江 大庆 163311）

目的 探讨环介导等温扩增法与胶体金免疫层析法在结核病病原菌快速检测效果比较。方法 选择2013年10月至2015年5月于我中心就诊的71例疑似结核病患者，分别取痰样本和血样本各71份，痰样本分别采用环介导等温扩增法和罗氏固体培养法进行病原菌检测。血样本采用胶体金免疫层析法进行病原菌检测。以罗氏固体培养法结果为参照，评价环介导等温扩增法和胶体金免疫层析法诊断的准确性。结果 以罗氏固体培养法结果为参照，环介导等温扩增法的灵敏度为90.32%，特异度为97.50%，准确率为95.77%；胶体金免疫层析法灵敏度为97.10%，特异度为100%，准确率为94.37%。结论 胶体金层析法和环介导等温扩增法均可获得较为满意的诊断结果，临床上可根据患者症状选择不同的诊断技术。

结核病；结核分枝杆菌；快速检测；免疫层析法；核酸扩增技术

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的局部组织肉芽肿和免疫反应的一种疾病。我国结核发病人数较高，位居世界第2位。结核病的诊断和治疗进展对提高我国人民健康水平有重要意义。结核病诊断的金标准为培养法，但耗时较长，即便采用较为先进的培养技术，也至少需要2周才能确诊，等待结果后再制定治疗方案会贻误病情，经验性治疗方案又容易造成结核分枝杆菌耐药。故快速诊断对结核病的治疗有重要影响。目前结核病快速诊断手段较多，包括涂片法、胶体金法、环介导等温扩增法、干扰素释放试验、核酸探针检查法及PCR检测法等[1]。而前3者的应用因操作简单便捷更为广泛。涂片法准确率低，已不能满足人们的需求。本研究纳入自2013年10月至2015年5月于我中心就诊的71例疑似结核病患者，分别取痰样本和血样本各71份，痰样本分别采用环介导等温扩增法和罗氏固体培养法进行病原菌检测，血样本采用胶体金免疫层析法进行病原菌检测，旨在分析两种常见的结核病病原菌快速检测技术优缺点，报道如下。

1 资料与方法

1.1 样本来源：选择2013年10月至2015年5月于我中心就诊的71例疑似结核病患者。纳入研究的患者年龄15～63岁，平均年龄（43.2±

10.6 ） 岁，病程3个月～2年。均为初次就诊。痰样本于清晨深部咯出，分成2份分别用于环介导等温扩增法和罗氏固体培养法检查。血样本于清晨自肘静脉取血5 mL，不抗凝处理，用于胶体金免疫层析法检查。

1.2 罗氏固体培养法：将等体积的4%氢氧化钠溶液加入到痰样本中，采用涡旋振荡器震荡20 s使其均匀化，室温下静置15 min后，于培养基斜面上接种0.1 mL样本，放置于37 ℃培养箱中孵育。接种3周后开始每周观察1次，8周内发现菌落生长，视为结核分枝杆菌培养阳性，反之则否。

1.3 环介导等温扩增法：将等体积的2.96%柠檬酸三钠和4%氢氧化钠混合液加入到痰样本中，采用涡旋振荡器震荡20 s使其均匀化，室温下静置15 min，以12 000 r/min的速度离心10 min，将上清液弃掉，生理盐水洗涤沉淀，并再次以12 000 r/min的速度离心10 min、弃上清液。在沉淀中加入200 μL的裂解液（2 mM EDTA、0.6%Triton-X100、20 mM pH8.0 Triso HCl），涡旋振荡器震荡20 s，沸水浴20 min，冷却，再经12 000 r/min的速度离心10 min，取上清液30 μL，放入反应试管中，60～65 ℃下加热60 min，加热器灭活反应试管中的酶，80 ℃下加热5 min。用紫外照射灯光照射对结果进行判读。肉眼观察到绿色荧光则为阳性，橙色则为阴性。

1.4 胶体金免疫层析法：血样本用于胶体金免疫层析法。结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒由上海奥普生物医药有限公司提供。血样本经离心处理后获得血清样本，备用。在反应孔中间先加入封闭液两滴，薄膜吸入后加血清样本40 μL，薄膜吸入后加入洗活液6滴，薄膜吸入后金标液2滴。结果判读需在60 s内完成，质控线和检测线均出现紫红色条带为阳性，仅有质控线出现紫红色则为阴性。

1.5 统计学方法：采用SPSS19.0进行数据的整理和统计。以罗氏固体培养法结果为参照，计算其他2种检查方法的灵敏度、特异度及准确率。2种方法均与罗氏固体培养法进行配对卡方检验（McNemar’s test）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

罗氏固体培养法结果为阳性43.66%（31/71），环介导等温扩增法结果为阳性40.85%（29/71），胶体金免疫层析法结果为阳性39.44%（28/71）。以罗氏固体培养法结果为参照，环介导等温扩增法的灵敏度为90.32%（28/31），特异度为97.50%（39/40），准确率为95.77%（68/71），配对卡方检验得P=0.5637，差异无统计学意义（P＞0.05）；胶体金免疫层析法灵敏度为97.10%（27/31），特异度为100%（40/40），准确率为94.37%（67/71），P=0.0833，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

胶体金法的原理是通过测定结核菌特异性外分泌蛋白MPB64确定诊断，操作简便、快速、重复性好，3 min即可完成操作，对结核菌的检出率高于涂片法。但由于结核菌的几个亚株不产生MPB64，胶体金法会显示假阴性，故在结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的鉴定上存在一定的局限性[2]。而对于免疫反应强的陈旧性肺结核患者，静止期时抗结核抗体可能持续一定的滴度[3]，故此时结果阳性只能说明患者曾有感染史，不能确定病情处于活动期。胶体金免疫层析法有4例误判为阴性，其可能为不产生MPB64的结核菌。就整体而言，胶体金免疫层析法灵敏度为97.10%，特异度为100%，P=0.0833，提示胶体金免疫层析法可获得较好的诊断效果。

环介导等温扩增技术是分子生物学诊断技术中的一种。其通过设计特定的引物可与结核分枝杆菌中DNA gry B和IS6110等区域相互识别，其特异性高，扩增效率高，时间短产物量大[4]。与其他分子生物学诊断技术相比，环介导等温扩增技术不需要昂贵的实验器材，应用一种酶即可进行扩增[5]，对实验室要求不高，更适合在临床推广。整个检测程序在2 h内即可完成。本研究结果显示环介导等温扩增法的灵敏度为90.32%，特异度为97.50%，准确率为95.77%，配对卡方检验得P=0.5637。提示与胶体金免疫层析法比较，环介导等温扩增技术操作相对复杂，但其一致性高。

综上所述，胶体金层析法和环介导等温扩增法均可获得较为满意的诊断结果。临床上如如症状较为典型，可采用胶体金免疫层析法给予快速确诊，如症状不典型，且不能区分结核分枝杆菌感染和非结核分枝杆菌感染时，推荐选择环介导等温扩增法。

[1] 陈琪,张轩,许红芳,等.结核分枝杆菌快速检测方法研究进展[J].国际检验医学杂志,2013,34(6):703-704.

[2] 白广红,李耀军,焦向阳,等.胶体金法快速检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的研究[J].国际检验医学杂志,2013,34(10):1274-1276.

[3] 黄胜,余继英,赵春艳,等.胶体金法检测结核抗体的临床价值探讨[J].临床肺科杂志,2014,19(6):1058-1060.

[4] 于霞,梁倩,马异峰,等.环介导等温扩增技术快速检测痰液标本中结核分枝杆菌的初步评价[J].中国实验诊断学,2013,17(5):846-849.

[5] 黄曙海,谭慧媚,戴广明,等.LAMP技术检测结核分枝杆菌试验性研究[J].应用预防医学,2011,17(1):1-4.

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1671-8194（2016）34-0073-02