血美安对特发性血小板减少性紫癜小鼠免疫细胞因子的调节作用

2016-01-29朱飞跃

中国老年学杂志 2015年22期

关键词：紫癜灌胃造模

朱飞跃　王　华

(娄底市中心医院血液内科,湖南　娄底　417000)

血美安对特发性血小板减少性紫癜小鼠免疫细胞因子的调节作用

朱飞跃王华1

(娄底市中心医院血液内科,湖南娄底417000)

〔摘要〕目的通过建立特发性血小板减少性紫癜(ITP)小鼠动物模型，观察血美安对ITP小鼠外周血细胞因子的影响，探讨血美安的免疫调节机制。方法40只Balb/c小鼠随机分为阴性对照组(A组)、模型组(B组)、阳性对照组(C组)、血美安(D组)组。除A组外，其余各组隔日注射豚鼠抗小鼠血小板血清(GP-APS)建立ITP小鼠模型。注射GP-APS 6 d后，A组和B组灌服0.9%氯化钠溶液，C组醋酸泼尼松按5 mg/kg灌胃，血美安胶囊按含药量为49.1 g/L灌胃。观察小鼠一般情况，连续给药14 d后处死小鼠;分离血清检测血小板、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素(IL)-4水平。结果与A组比较，IFN-γ水平显著升高(P<0.05);血小板和IL-4水平显著下降(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值升高。与B组比较，D组IFN-γ水显著下降(P<0.05);血小板和IL-4水平显著升高(P<0.05)，IFN-γ/IL-4比值降低具有显著差异(P<0.05)。结论血美安可通过影响Th1/Tp细胞因子水平而对ITP免疫功能起到调节作用。

〔关键词〕血美安;特发性血小板减少性紫癜;血小板;干扰素-γ;白细胞介素-4

1中南大学湘雅医院眼科

第一作者：朱飞跃(1970-),女,副主任医师,主要从事血小板减少性紫癜的中药治疗研究。

特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种获得性的自身免疫性疾病，其特点为无明显外源性病因引起的血小板数目减少和皮肤黏膜的出血，是临床最为常见的出血性疾病，其发病与T细胞的异常激活、T细胞亚群及其功能改变等有关〔1〕。ITP是一种血小板在体内被破坏导致出血的自身免疫性疾病，免疫异常已构成了发病机制的核心。已有研究表明Th1/Tp的比例增高与ITP的发病和疾病状态密切相关，并且呈明显Th1优势反应〔2〕，临床研究表明血美安胶囊对 ITP 治疗床应用效果理想且无明显毒副作用〔3〕，但其对免疫功能调节作用机制尚不清楚，本实验拟通过建立与ITP动物模型，并以血美安进行干预治疗，检测ITP小鼠血清细胞因子干扰素(IFN)-γ和白细胞介素(IL)-4的水平，探讨该药物治疗ITP的免疫调节作用机制。

1材料与方法

1.1模型制备本动物实验使用二级Balb/c小鼠，体重18～22 g，8周龄，共60只，雌雄各半(由南华大学动物实验中心提供)。 40只小鼠按随机数字表法随机分为阴性对照组 (A 组)10 只、模型组 (B 组)10只、泼尼松阳性对照组(C 组)10只、血美安组(D 组)10只。造模参考文献〔4～6〕制作实验性ITP动物模型，即用豚鼠抗Balb/c小鼠血小板血清(APS)给Balb/c小鼠尾静脉注射，于造模第1，3，5，7，9，11，13天给小鼠尾静脉注射 APS 20 μl/20 g，造成小鼠外周血小板持续减少(相当于正常值25%)即为成功模型。

1.2干预方法A 组：正常饲养，并予等量生理盐水灌胃(四川科伦药业股份有限公司生产，批准文号：国药准字B040503-02)。B 组：以上述等量生理盐水灌胃。C 组：予泼尼松0.5 mg/ml灌胃(浙江仙琚制药有限公司生产，批准文号：国药准字p3021207)。D 组：以血美安胶囊灌胃(珠海安生凤凰制药有限公司生产，批号：国药准字Z20050633)，将胶囊中的颗粒粉末以生理盐水配成混悬液，含药量为49.1 g/L灌胃。除正常组外，其余 3 组小鼠均按上述方法造模，并于造模第6日起均按 0.2 ml/10 g 体质量灌胃，每日 1 次，连续 9 d。

1.3观察指标为观察、监测整个实验过程中小鼠模型一般情况，是否能维持理想状态，在实验过程中先后以尾静脉采血法以检测对比小鼠血小板(PLT)计数情况。各组小鼠于造模第 15 日处死取材。观察一般情况，不良反应，死亡情况，血小板计数变化，故最终实验结束时，各组取材小鼠数分别为A组10只，B组8只，C组9只，D 组10 只。取小鼠外周血，ELISA方法检测血清IFN-γ和 IL-4。96孔板分别加入标准品、样品稀释液和待测样品100 μl，37℃ 60 min，洗板5次，甩干;加生物素化的抗小鼠IFN-γ、IL-4 抗体100 μl，37℃ 60 min，洗板同前;加HRP标记的亲和素100 μl，37℃ 30 min，洗板同前;加底物工作液(TMB)100 μl，37℃避光15 min，加终止液100 μl，用酶标仪在450 nm处测吸光值(OD值)。绘制标准曲线，所有样品孔OD值均减除空白孔值后计算IFN-γ和IL-4含量。

1.4统计学方法应用 SPSS16.0 软件行t检验及方差分析。

2结果

2.1各组小鼠一般情况观察 A组小鼠反应灵活，毛色光润，喜活动，主动觅食，大便呈条状。B 组小鼠在造模后的第 5 日即出现软便，伴有活动减少、喜扎堆、拱背、竖毛、毛不光洁等现象。注射APS 后 24 h，除 A 组外，其余各组小鼠均出现明显的皮下紫癜，可见到四肢、腹部、尾部有不同程度出血点和瘀斑。造模第 4 至 5 日出血点和瘀斑最为明显。在造模第 14 日，与 B 组比较，C、D给药组小鼠皮下紫癜都有不同程度减轻，其减轻程度各组基本相似。B 组及 C 组各有 12只和 21只小鼠在灌胃时出现死亡，尸解见肺部有挫裂伤，气管内残留灌胃药液，考虑死亡原因为灌胃时灌胃器误插入气管，导致小鼠窒息及肺部受损所致。

2.2血美安对ITP模型小鼠外周血血小板数量、细胞因子的影响与A组比较，B组IFN-γ水平升高，IFN-γ/IL-4比值明显升高，外周血血小板数量和IL-4水平下降(P<0.01)。与B组比较，A组和D组均能降低ITP小鼠血清IFN-γ水平，显著提升外周血血小板数量和IL-4水平，从而显著减低IFN-γ/IL-4比值(P<0.05)。见表1。

表1　血美安胶囊对ITP模型小鼠外周血血小板计数、

与A组比较：1)P<0.01；与B组比较：2)P<0.05

3讨论

ITP是一种获得性的自身免疫性疾病，它是一种由血小板自身抗体所致的血小板减少性疾病，常反复发作，其特点为无明显外源性病因引起的血小板数目减少和皮肤黏膜的出血，是临床最为常见的出血性疾病〔7〕，其发病与T细胞的异常激活、T细胞亚群及其功能改变等有关。慢性原发性血小板减少性紫癜(CITP)病程较长，大多在1年以上，治疗棘手。另外，病人多反复使用肾上腺糖皮质激素治疗，长期应用激素治疗无效，停用激素后副作用多〔8，9〕。近年来，中医对于血小板减少性紫癜的治疗取得了一定的成就，由猪蹄甲、地黄、赤芍、牡丹皮3种成分组合的血美安胶囊用于血热伤阴夹瘀所致皮肤紫癜、赤衄、鼻衄、妇女月经过多、口渴、烦热、盗汗等ITP。但是，此药物药理机制研究仍然存在着一些问题：①缺乏公认的、统一的诊断及疗效标准。有的医家也未将急性型与慢性型区分开来，从而造成疗效分析缺乏客观性、公正性〔10，11〕；②该病除了活血化淤法在临床和实验方面研究较深入外，其对ITP免疫功能从实验角度研究其作用机制较少。本研究通过连续小鼠腹腔注射抗小鼠血小板抗体，使小鼠体内血小板持续处于低水平，成功建立ITP模型。此种方法建立的模型不损害其他脏器特性又符合其发病的原因〔12〕，其临床表现与ITP基本一致，便于直接观察药物的治疗效果。本研究证实，血美安可能主要通过减低IFN-γ和提高IL-4水平影响Th1/Tp比值，调节ITP产生的细胞免疫功能紊乱，从而升高外周血血小板数量。

4参考文献

1张之南，沈梯.血液病诊断及疗效标准〔M〕.第3版.北京:科学出版社，2008：172-6.

2王缨，夏为军．加味小柴胡颗粒及其组方对ITP模型小鼠免疫功能的影响〔J〕.中国免疫学杂志，2008;24(2)：131-4.

3朱艳，匡跃敏，蒋志勇，等．血美安胶囊联合激素治疗特发性血小板减少性紫癜疗效观察〔J〕.浙江中西医结合杂志，2011;21(12)：131-4.

4葛卫红，郭建友，石森林，等．血康口服液对小鼠血小板减少性紫癜模型的作用机理探讨〔J〕.中国实验方荆学杂志,2007;13(3)：47．

5王缨，朱建军．加味小柴胡对小鼠免疫性血小板减少性紫癜下丘脑-垂体-肾上腺系统的影响〔J〕.北京中医药大学学报，2008;31(8)：553-6．

6吴晓勇，李冬云，陈信义，等.益髓颗粒对免疫性血小板减少性紫癜模型小鼠细胞相关因子表达影响〔J〕.中华中医药杂志，2010;25(6):849-52.

7王兆钺.免疫性血小板减少性紫癜的发病机制与临床研究进展〔J〕.中国免疫学杂志，2009;25(12):1141-4.

8王迎春，阮长耿.小剂量糖皮质激素联合肿节风治疗原发性血小板减少性紫癜的初步报告〔J〕.江苏临床医学杂志，2002;6(3)：193-5.

9陈新瑜，罗本清．治疗原发性血小板减少性紫癜经验〔J〕.中国中医急症，2006;7(10)：1121.

10郑筱萸．中药新药临床研究指导原则〔S〕.北京：中国医药科技出版社，2002:180-8.

11谢雁呜，王永炎，翁维良，等．中医临床方案优化的思路与方法探析〔J〕.世界科学技术中医药现代化，2008;10(1)：22-6.