李英夫，李明军，廉晓宇，宣兆博

(佳木斯大学附属第一医院神经外科,黑龙江 佳木斯 154003)



榄香烯和VEGF多克隆抗体联合应用对大鼠脑胶质瘤增殖的影响①

李英夫，李明军，廉晓宇，宣兆博

(佳木斯大学附属第一医院神经外科,黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的:对Wistar大鼠脑胶质瘤增殖中应用VEGF多克隆抗体与榄香烯联合应用的抑制效果进行分析与探讨。方法：构建Wistar大鼠脑胶质瘤模型，此模型为脑胶质瘤模型，胶质瘤细胞为SHG-44，大鼠接种成瘤后将其随机分为4组，每组大鼠8只，A组大鼠给予生理盐水，B组大鼠给予榄香烯，C组大鼠给予VEGF多克隆抗体，D组大鼠给予VEGF多克隆抗体与榄香烯。镜下对肿瘤组织病理切片进行观察。结果：研究组肿瘤标本坏死灶较多，肿瘤细胞中含有大量核破裂，而对照组肿瘤标本具有较多血管数量，血管管壁增厚，肿瘤血管减少量与组织坏死程度D组明显多于B组与C组。结论：研究表明，VEGF多克隆抗体与榄香烯联合使用对肿瘤组织生长具有有效抑制作用，具有协同作用，VEGF多克隆抗体与榄香烯对细胞凋亡具有促进作用，两者联合使用存在协同效应。

关键词：VEGF多克隆抗体；榄香烯；Wistar胶质瘤模型

本研究为对Wistar大鼠脑胶质瘤增殖中应用VEGF多克隆抗体与榄香烯联合应用的抑制效果进行分析与探讨，构建Wistar大鼠脑胶质瘤模型，具体报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

由吉林医学院生化研究机构提供胶质瘤细胞株，并从佳木斯大学动物实验中心购置Wistar大鼠，选用美国BD公司生产的流式细胞仪，日本CK公司生产的倒置显微镜，L eica CM1100切片机。

1.2方法

1.2.1动物接种与分组

通过酒精与强力碘为大鼠背部进行消毒，6号针头注射器将1mL大鼠细胞悬液抽取出来，接种在大鼠脑部尾状核，并于每2d对肿瘤生长情况进行观察，5d左右即可触及皮下肿瘤，14d皮下肿瘤直径就可达15mm，把呈椭圆形或者圆形，直径大约15mm生长合格的肿瘤当作试验肿瘤模型，随机分为4组，每组有大鼠8只，将其分开饲养，且命名为A、B、C、D组，A组(对照组)大鼠给予生理盐水，B组(研究组)大鼠给予榄香烯，C组(研究组)大鼠给予VEGF多克隆抗体，D(研究组)组大鼠给予VEGF多克隆抗体与榄香烯。

1.2.2悬液制备与细胞培养

SHG-44来源于人额叶星形胶质瘤的稳定培养，具有特异性标志胶质酸性纤维蛋白(GFAP)，SHG-44是目前较理想的细胞株，能够稳定的培养，并在Wistar大鼠尾状核区成功植入，将复苏成功的SHG-44细胞株，放于50cm2培养瓶中接种，DMEM培养基中含有10%灭活的胎牛血清，还含有链霉素100mg/mL、青霉素100U/mL、NaHCO33.7g/L，培养瓶置于5%CO2的培养箱中，温度恒定于37℃，SHG-44细胞满瓶后,将培养液倾倒出去,0.25%胰酶消化培养瓶中的SHG-44细胞,显微镜下观察SHG-44细胞，当细胞开始皱缩时,加入营养液,并反复吹打，使SHG-44细胞脱壁,并用离心机离心5min，离心转数为1000r/min，将上清液弃出，制成106细胞/瓶的细胞悬液,接种于25cm2培养瓶中[1]。

1.2.3动物模型制作前准备

全实验过程每周两次注射地塞米松，0.15mg腹腔内注射，接种前3d，每日给予地塞米松，剂量为100g体重1mg，给药方式为灌胃，降低排斥反应，用10%水合氯醛麻醉，给药剂量为每10g体重0.4mL，剪去穿刺点周围毛，面积约1.0cm×1.5cm。

1.2.4模型制作

植入靶点为右侧尾状核区，穿刺点为矢状缝右旁开3.5mm和前囟中点前1.0mm，麻醉满意后，将Wistar大鼠固定于立体定向仪上，剪去穿刺点周围毛,高效碘消毒,铺无菌洞巾，切开内眦连线与正中矢状面交点向后1mm，定位预先穿刺点，牙科钻颅骨钻孔，直径1.2mm，用1mm微量注射器针头刺破硬膜，向下垂直进入硬膜下6mm, 再后撤1mm，将细胞悬液1×106/20μL，以每分钟1μL的速度缓慢注入右侧尾状核区，穿刺针停留5min，骨蜡封闭骨孔，缝合头皮[1]。

1.2.5给药方法

VEGF多克隆抗体给药量为50 只，榄香烯为20mg/kg,根据1mg:1000mL的比例对VEGF多克隆抗体进行稀释， 1%榄香烯剂型是20mL中含20mg，通过生理盐水将榄香烯配置为100mL中含100mg，大鼠腹腔隔日给予VEGF多克隆抗体与榄香烯。

1.3肿瘤病理学观察

10%中性甲醛固定肿瘤组织，石蜡包埋，5μm层厚切片，HE常规染色，并于光镜下对组织切片进行分析。7d时进行头部MRI检查，将成瘤的大鼠作为实验对象，分别于接种后的7、14、21d、自然死亡的几个时间点观察大鼠的生存状态，包括如下几个方面：饮食情况；肢体是否有活动障碍；颅神经是否有功能确实；以及视觉反应；全身抽搐和持续时间等。21d处死大鼠和死亡的大鼠进行HE染色，光镜下观察。

1.4统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计学处理，两组采用Q检验，方差分析多组，P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1肿瘤病理学观察

在光镜下对Wistar大鼠胶质瘤标本进行观察发现呈小梭形，具有较大细胞核，呈异形，易发现核分裂相，染色质丰富，很少有细胞质，细胞略微突起，研究组肿瘤标本坏死灶较多，肿瘤细胞中含有大量核破裂，肿瘤血管减少量与组织坏死程度D组明显多于B组与C组。

2.2各组影响肿瘤细胞凋亡机制

A、B、C、D组细胞凋亡率分别是(0.47±0.18)%、(13.0±1.60)%、(11.8±1.60)%、(19.5±1.31)%，组件肿瘤细胞凋亡率相比，差异性比较明显，具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　各组标本肿瘤细胞凋亡率

3　讨论

临床中，神经质瘤具有较高的发病率，而且是一种比较常见的颅内恶性肿瘤，其所占比例大约为37.5%~60.5%，目前在治疗该方面的进展也比较慢，现阶段常规治疗胶质瘤主要是手术治疗，术后再行化疗与放疗。近年来，阐明肿瘤血管病理生理后，为治疗肿瘤开辟更多新途径。VEGF(血管内皮生长因子)对血管发生与形成具有调节作用，在形成肿瘤过程中具有关键作用[3]。而且VEGF抗体可结合循环VEGF，是VEGF蛋白构向得以转变，有效遏制VEGFR和VEGF结合位点，避免VEGF结合内皮细胞VEGFR，对VEGF信号通路具有阻断作用，有效抑制内皮细胞迁移与增殖，而且对血管形成也具有抑制性作用[4]。榄香烯提取物为姜科植物温郁金，其主要成分为β-榄香烯，属于萜烯类化合物，且含少量γ与α榄香烯，相关药理学研究发现，榄香烯能够有效杀伤与抑制体内肿瘤细胞。临床研究显示，在多种肿瘤中，榄香烯疗效确切，而且能够有效对抗神经胶质瘤。本研究结果显示，研究组肿瘤标本坏死灶较多，肿瘤细胞中含有大量核破裂，而对照组肿瘤标本具有较多血管数量，血管管壁增厚，肿瘤血管减少量与组织坏死程度D组明显多于B组与C组。研究表明，VEGF多克隆抗体与榄香烯联合使用对肿瘤组织生长具有有效抑制作用，具有协同作用，VEGF多克隆抗体与榄香烯对细胞凋亡具有促进作用，两者联合使用存在协同效应。

参考文献：

[1]关晓燕. 榄香烯对人胶质瘤U251细胞株体外放射增敏机制研究[J].中南大学，2012:123-124

[2]李英夫，李明军. Wistar 大鼠SHG - 44 脑胶质瘤动物模型建立[J].黑龙江医药科学，2015，38(2)：24-25

[3]许浪,刘丹.榄香烯诱导肺癌A549细胞凋亡作用的剂量和时间依赖性研究[J].中国现代药物应用，2009,(6):108-109

[4]廉晓宇，李显伟.榄香烯和VEGF多克隆抗体联合应用对C6胶质瘤增殖抑制作用的研究[J].黑龙江医药科学，2009，32(1)：14-15

中图分类号:R742

文献标识码：B

文章编号：1008-0104(2015)06-0099-02

作者简介：①李英夫(1979～)男，黑龙江明水人，硕士，主治医师。

通讯作者：李明军(1965～)男，黑龙江佳木斯人，学士，主任医师。E-mail:liyingfu79@sohu.com。

(收稿日期：2015-07-03)