王　歆，方　舟，方　芳，沈德凤，荆洪英

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院药剂科，黑龙江 佳木斯 154003)



糖尿病患者IRS-1和MTHFR基因多态性分析①

王歆1，方舟2，方芳2，沈德凤1，荆洪英2

(1.佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2.佳木斯大学附属第一医院药剂科，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通过比较本地区健康人与糖尿病患者IRS-1和MTHFR基因多态性的差异，探索IRS-1和MTHFR基因多态性与糖尿病发病的关系。方法：采用荧光原位杂交法检测健康人和糖尿病患者IRS-1和MTHFR的基因型分布，通过χ2检验来比较健康人和糖尿病患者的基因型分布的差异。结果：健康人和糖尿病患者的IRS-1基因型分布差异没有显著性差异(P>0.05)；健康人和糖尿病患者的MTHFR基因型分布有显著性差异(P<0.05)。结论：糖尿病的发生与MTHFR的碱基变异具有相关性。

关键词：IRS-1；MTHFR；基因多态性；荧光原位杂交；糖尿病

在糖尿病因与治疗的探讨中，基因多态性对2型糖尿病形成与治疗是目前医务工作者关心的课题之一。IRS-1是首先发现的胰岛素受体底物, 它作为调节B细胞功能的重要信号分子,主要调节胰岛素分泌。它在胰岛素作用的外周组织如骨骼肌、脂肪、肝脏等均有分布,但主要在骨骼肌表达。IRS-1抑制内质网上钙离子ATP酶,使细胞内钙离子浓度升高,从而激活蛋白激酶C,刺激胰岛素释放[1]。研究表明，IRS-1基因存在多种多态性,其中部分与糖尿病或胰岛素抵抗有关。

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase gene MTHFR)MTHFR C677T 基因突变是目前发现的 MTHFR 基因最常见的不耐热错义突变，MTHFR基因的677位碱基胞嘧啶(Cytosine, C)被胸腺嘧啶(Thymine,T)置换，使编码的丙氨酸(Ala)变异为缬氨酸(Val)而产生多态性[2~4]。MTHFR基因位于染色体1q36.3，编码区长1980bp， MTHFR C677T 具有相对较高的突变频率，MTHFR基因突变是心血管病变的危险因素，尤其在糖尿病视网膜病变和糖尿病肾病中，MTHFR基因突变率明显高于对照组[5]。本研究对 IRS-1基因和MTHFR基因单核苷酸多态性进行分析，探索IRS-1 SNP rs2943650，MTHFR SNP rs1801133与糖尿病的相关性，为临床用药提供理论依据。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2014-06~2015-06住院的2型糖尿病患者108例，健康人90例，糖尿病诊断依据WHO1998年新的诊断标准，排除1型糖尿病、妊娠型糖尿病和特殊类型糖尿病，见表1。

仪器和试剂有 TL-988实时荧光定量PCR仪：西安天隆科技仪器有限公司；荧光原位杂交DNA测序分析程序：北京华夏时代基因科技发展有限公司；掌式离心机：珠海博迈杰生物科技有限公司；HC-3017高速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司；PHARM-GENE 01 SNP分析保存液，PHARM-GENE 200 SNP分析样品处理试剂(北京华夏时代基因科技发展有限公司)。

表1　糖尿病组与对照组一般资料

1.2方法

1.2.1基因多态性检测方法

取150μL新鲜全血加入含有1000μL氯化铵溶液的Eppendorf 管中，混合混匀后室温放置5min，3000r/min(700g)离心5min，用移液器吸出上清液。在富集了白细胞的管中加入100μL耀金保，震荡混合混匀，室温放置20~30min。吸取本液1.0~1.5μL加入待测基因对应的耀金分试剂中，漩涡混合均匀，瞬时离心，上至机器中检测；检测条件：95℃预变性600s；95℃变性30s，62℃复性75s，45或50个循环。在样品检测的同时，加测3种不同基因型的质控品作为对照。

1.2.2基因型的判断

当一条基因荧光曲线值高于另一条基因荧光曲线，且两条曲线的St差值比杂合子要大，或者其中一条曲线的St值为-1，根据曲线颜色判断为野生或突变纯合子。当两条荧光曲线几乎同时升起，且趋势大致相同，达到平台期的时间也相近，两条曲线St值等于或小于质控品的杂合子St值之差，判断为杂合子。并将检测的样品荧光曲线图与质控品曲线图进行比较。

IRS 1 SNP rs2943650荧光拟合曲线如图1；MTHFR SNP rs1801133荧光拟合曲线如图2。

图1　IRS 1 SNP rs2943650(C>T)荧光拟合曲线

图2　MTHFR SNP rs1801133(C>T)荧光拟合曲线

1.3统计学方法

采用SPSS11.0统计软件，采用χ2检验来计算糖尿病组和健康人组的三种基因型的分布频率，P<0.05为差异具有显著性。

2　结果

分别检测IRS-1 SNP rs2943650，MTHFR SNP rs1801133基因多态性，计算各基因型的分布频率，见表2~3。

表2　IRS-1 SNP rs2943650基因多态性与糖尿病的关系(%)

由表2看出，两组rs2943650三种基因型频率的分布没有显著性差异(P>0.05)。

表3　MTHFR SNP rs1801133基因多态性与胰岛素抵抗的关系(%)

由表3可见，两组rs1801133三种基因型频率的分布有显著性差异(P<0.05)。

3　讨论

荧光原位杂交法检测技术快捷、准确，适用于医院对患者基因型的检测。随着精准医学和分子生物学的发展，一些药物相关基因多态性与疾病的相关性研究越来越受关注[6~9]，为临床疾病的诊断和治疗提供了依据。IRS-1 基因是引起胰岛素抵抗的重要基因，IRS-1是位于胰岛素级联信号上的第一个受体底物，该基因位于染色体 2q36-37，其编码产物 IRS-1 是分布于胰岛素敏感组织内的信号转导蛋白。当IRS-1 出现异常时，胰岛素信号传导发生改变，影响机体对胰岛素的利用，就会产生胰岛素抵抗[10]。近年的研究结果显示，同型半胱氨酸(homocysteine,Hey)不仅与2 型糖尿病发病有相，还与其血管、神经等并发症密切相关，糖尿病患者血清Hcy水平如高于正常人，就有增加主动脉硬化的风险和易产生胰岛素抵抗[11]。Frosst等发现MTHFR rs1801133位点不易受外界环境影响而发生突变[12]，可能会造成 MTHFR 活性降低而导致同型半胱氨酸的甲基化紊乱，引起高同型半胱氨酸血症。因此，MTHFR 基因突变可能是 2 型糖尿病发病的一个危险因素。

参考文献：

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[12]Frosst P ，Blom HJ ，Milos R ，et al ． A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methyl -lenetet-rahydrofolate reductase[J]． Nat Genet，1995，10( 1) : 1112-1113

中图分类号：R587.1

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2015)06-0046-02

基金项目：①佳木斯大学科学技术面上项目，编号：S2014-031。

作者简介：王歆(1988～)女，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生。

通讯作者：荆洪英(1965～)女，黑龙江鸡西人，学士，主任药师，硕士研究生导师。E-mail:fangzhou84@163.com。

(收稿日期：2015-06-15)