高英英，辛　华，孙玉鸿，赵　婧，马　雷

(1.佳木斯大学检验医学院,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)



山楂叶总黄酮治疗大鼠动脉粥样硬化作用的分子机制研究①

高英英1，辛华2，孙玉鸿2，赵婧1，马雷2

(1.佳木斯大学检验医学院,黑龙江 佳木斯 154003;2.佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：以山楂叶总黄酮为主要药物治疗AS大鼠，以此研究该病的分子机制，为临床寻找治疗AS的新途径。方法：以AS造模大鼠为研究对象，通过自动生化分析仪检测血清血脂四项，ELISA法检测外周血血清MCP-1、MMP-9和TIMP-1三种蛋白含量，通过RT-PCR检测这三种蛋白mRNA的表达量。结果：形态学观察大鼠造模成功，模型组与正常对照组比较，血脂四项有显著性差异，血清中MCP-1、MMP-9和TIMP-1三种蛋白含量明显升高，其mRNA表达水平显著升高。山楂叶总黄酮治疗组与模型组比较，MCP-1和MMP-9含量显著降低，TIMP-1含量显著升高，其mRNA表达量也呈相应改变，呈一定的剂量相关性。结论：山楂叶总黄酮在治疗和预防AS中起到了阻止早期发生，扭转病情，减缓发展的作用，为临床提供了一种较好的中药治疗选择。

关键词：山楂叶总黄酮；MCP-1；MMP-9；TIMP-1

动脉粥样硬化 (atherosclerosis，AS)是多种心脑血管疾病的首要病理因素，在欧美等发达国家，病死率一直居首位。在我国，由于人民的生活水平的提高和生活习惯的变化，AS的发病率较已往明显的增高。有研究表明，AS的形成过程主要依赖于动脉血管内膜的破损，进而引起外周血液循环中的单核细胞吸附，最后形成吞噬细胞，转变为摄取脂肪的泡沫细胞[1]。所以，研究AS形成过程中炎症相关因素的发病机制，寻找缓解并治疗AS的药物至关重要。本课题组以中草药山楂叶总黄酮为主要药物治疗造模大鼠AS，从而研究该病的发生、发展的分子机制，以期为临床提供一个治疗AS的新方法。

1　资料与方法

1.1实验动物

选取大鼠50只，来自佳木斯大学动物实验中心，平均体重(235±30)g，随机分为5组，每组10只。设立正常对照组、模型组、山楂叶总黄酮大剂量组、中剂量组和小剂量组。

1.1.2药物和试剂

山楂叶总黄酮选自临沂爱康药业有限公司 ，批号AKH010-B，纯度为90%。丙基硫氧嘧啶为上海复星朝晖，批号091209。RT-PCR试剂盒选自大连宝生物工程有限公司，血脂四项检测试剂盒选自南京建成生物工程研究所，ELISA血清蛋白检测试剂盒选自上海西唐生物科技有限公司。

1.1.3主要仪器

基因扩增仪Biometre公司，DYC-33B型水平电泳槽北京八一仪器厂，凝胶成像处理系统上海天能科技有限公司，ZF-90型暗箱式紫外透射仪上海顾村电光仪器厂，光学显微镜OlympusX51，生化分析仪BECKMANAU5800，DNM9602G型酶标仪北京普朗技术有限公司。

1.2方法

1.2.1造模及给药

正常对照组给予正常颗粒饲料，正常颗粒饲料的主要成分和比例：玉米：55%；豆粕：22%；麦麸：16%；鱼粉：5%；氨基酸：1%食盐：0.9%；微量元素：0.1%；以上均由佳木斯大学动物实验中心提供。模型组和给药组给予高脂饲料和按照60万单位/kg体重一次性腹腔注射维生素D3。高脂饲料的主要成分是在正常颗粒饲料的基础上添加胆固醇、胆酸钠、丙基硫氧嘧啶、白糖和猪油[2]，由佳木斯大学实验动物中心负责压制成颗粒饲料。

喂养4周后，球后静脉取血，测定血脂四项，评价造模是否成功。从第5周开始，给药组每天一次灌胃给药，给予山楂叶总黄酮的剂量为大剂量组按照250mg/kg，中剂量组为125mg/kg，小剂量为62.5mg/kg。同时模型组给予250mg/kg的生理盐水。第8周结束时，采用断尾取血法，留取血液，低速离心，吸取血清置-20℃冷冻备用。处死大鼠后仔细挑取主动脉弓与胸主动脉交界处血管，清洗血迹后，部分保存在10%酸性甲醛中，其余标本保存在液氮罐中备用。

1.2.2显微镜观察动脉组织结构

将甲醛固定的血管标本送往佳木斯大学基础医学院病理教研室，通过HE染色后观察动脉组织结构。

1.2.3血清血脂四项检测

将留取的血清标本送往佳木斯大学附属第一医院检验科生化室，由专业人员严格按照试剂说明书要求，检测总胆固醇(Total cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density cholesterol, LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High density cholesterol, HDL-C)及TC/HDL-C。

1.2.4 ELISA检测三种蛋白

将留取的血清标本送往佳木斯大学附属第一医院检验科免疫室，由专业人员严格按照试剂说明书要求，检测血清中单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of matrix metalloprotein-1 ,TIMP-1)三种蛋白的含量。

1.2.5PR-PCR基因检测

将液氮保存的动脉组织精确称取1g，严格按照RT-PCR试剂盒说明书要求检测MCP- mRNA 1，MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA三种基因的表达量。

1.3统计学方法

2　结果

2.1显微镜观察动脉血管结构

对照组:肉眼可见大鼠主动脉血管壁内膜光滑。镜下观察可见内皮细胞完整，内皮细胞连接紧密，中膜层平滑肌细胞厚度均匀一致，成梭型排列整齐。模型组: 肉眼可见大鼠主动脉血管有少量黄色的脂样斑块并向管腔内凸起，主要分布在近主动脉弓处，严重者可覆盖整个血管内膜。镜检可见内膜细胞体积增大，部分有脱落现象，内皮细胞之间间隙增宽，其表面有较多的单核细胞侵润，可见大量巨噬细胞和脂肪空泡，说明大鼠AS模型造模成功。大剂量组：肉眼可见有少量黄色的脂样斑块并凸向管腔，病变表现与模型组相似，但是病变程度较轻，镜下观察可见内膜尚完整且较平坦，与模型组比较，其内膜增厚的程度及黏附并浸润于内膜下的单核细胞均明显减少。小剂量组：肉眼可见少量脂样斑块，镜检可见内膜细胞体积较大，内皮细胞之间间隙较宽，含有较多的单核细胞侵润，含有少量的脂肪空泡。中剂量组：形态结构介于大、小剂量组之间。

2.2山楂叶总黄酮和各组血清血脂四项水平的关系

模型组与对照组比较， TC、LDL-C和TC/HDL-C都由显著性差异(P<0.01)，TG差异具有统计学意义(P<0.05),HDL-C差异没有统计学意义。给药组与模型组比较，其中，大剂量组TG、TC、HDL-C和LDL-C差异都有统计学意义(P<0.05)，其中TC/HDL-C有显著性差异(P<0.01)。中剂量组与模型组比较，只有HDL-C一个指标没有统计学意义。小剂量组与模型组比较，只有TC/HDL-C有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　山楂叶总黄酮和各组血清血脂四项水平的关系±s，n=10)

组别TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL-C(mmol/L)LDL-C(mmol/L)TC/HDL-C对照组0.98±0.042.79±0.051.11±0.081.48±0.052.60±0.04模型组1.49±0.01*4.85±0.03**1.06±0.052.89±0.04**4.40±0.04**大剂量组1.06±0.07#4.01±0.03#1.59±0.05#1.78±0.06#2.39±0.02##中剂量组1.25±0.03#3.63±0.05#1.24±0.071.72±0.08#2.46±0.06##小剂量组1.38±0.042.891±0.071.12±0.081.53±0.052.50±0.04#

注：与对照组比较*P<0.05,**P<0.01；与AS模型组比较#P<0.05,##P<0.01。

2.3山楂叶总黄酮与外周血MCP-1、MMP-9、TIMP-1三种蛋白含量的关系

模型组和给药组与正常组比较，三种蛋白和MMP-9/TIMP-1四个指标均有显著性差异(P<0.01)。给药组与模型组比较，大剂量组三种蛋白和MMP-9/TIMP-1四个指标均有显著性差异(P<0.01)。中剂量组MMP-9、TIMP-1和MMP-9/TIMP-1三个指标有显著性差异(P<0.01)。小剂量组只有MMP-9/TIMP-1有显著性差异(P<0.01)。见表2。

表2　山楂叶总黄酮与外周血MCP-1、MMP-9、TIMP-1三种蛋白含量的关系

组别MCP-1(pg/mL)MMP-9(ng/mL)TIMP-1(ng/mL)MMP-9/TIMP-1对照组90.32±7.69160.89±6.8370.12±8.972.21±0.15模型组256.33±11.84*339.62±10.71*89.66±9.15*3.65±0.17*大剂量组179.63±10.21*#281.55±8.02*#120.61±8.54*#2.30±0.15*#中剂量组213.12±10.05*297.03±10.64*#109.66±9.17*#2.90±0.21*#小剂量组229.44±7.85*325.66±10.92*98.92±9.32*3.21±0.12*#

注：与对照组比较*P<0.01；与AS模型组比较#P<0.01。

2.4山楂叶总黄酮和动脉组织三种蛋白mRNA及MMP-9/TIMP-1相对表达量的关系

模型组和给药组与正常组比较，三种蛋白mRNA和MMP-9/TIMP-1四个指标均有显著性差异(P<0.01)。给药组与模型组比较，大剂量组三种蛋白mRNA和MMP-9/TIMP-1四个指标均有显著性差异(P<0.01)，中剂量组MMP-9和MMP-9/TIMP-1两个指标有显著性差异(P<0.01)，小剂量组只有MMP-9/TIMP-1有显著性差异(P<0.01)。见表3。

表3　山楂叶总黄酮和动脉组织三种蛋白mRNA及MMP-9/TIMP-1相对表达量的关系±s)

组别MCP-1mRNAMMP-9mRNATIMP-1mRNAMMP-9/TIMP-1对照组0.38±0.060.45±0.030.50±0.060.79±0.04模型组1.03±0.05*1.01±0.06*0.66±0.05*1.50±0.05*大剂量组0.56±0.04*#0.80±0.05*#0.89±0.06*#0.89±0.07*#中剂量组0.69±0.06*0.88±0.06*#0.82±0.05*1.10±0.06*#小剂量组0.84±0.11*0.96±0.05*0.78±0.04*1.30±0.07*#

注：与对照组比较*P<0.01；与AS模型组比较#P<0.01。

3　讨论

近年来，由于AS致死人数已过半数，远远超过肿瘤。AS主要侵害循环系统中主动脉、冠状动脉和脑动脉等大、中动脉。1999年，Ross等明确提出作为一种炎症疾病，AS具有变质、渗出、增生等病理特征，而且其发展也始终伴随慢性炎症反应过程[3，4]。AS的大量研究中显示[5～7]，高胆固醇血症、高甘油三酯血症是AS病变的始动环节。本课题模型组与正常组比较，大鼠的TC、LDL-C和TC/HDL-C都由显著性差异，TG差异具有统计学意义，结果表明TC、LDL-C和TG含量与冠心病发病率明显相关。而山楂叶总黄酮给药组这三个指标明显下降，呈剂量依赖性，大剂量组HDL-C显著升高，表明山楂叶总黄酮可能通过影响大鼠血脂的方式来治疗AS。MCP-1对单核细胞具有非常强大的诱导作用，促使单核细胞在AS的早期进入血管内膜，在大鼠AS模型组的血清中和动脉组织中我们都检测到大量的MCP-1蛋白和mRNA，同正常组比较，具有显著性差异。正常情况下MMP-9和TIMP-1在动脉壁处于一种动态的平衡，二者相互影响制约，当发生AS时这种平衡被打乱[8]，本实验结果表明AS模型组大鼠血清及动脉组织中的MMP-9和TIMP-1两种蛋白和其mRNA水平明显高于正常对照组。然而TIMP-1增高的幅度没有 MMP-9显著，从而使得MMP-9/TIMP-1明显的升高，说明AS纤维帽胶原的消融超过了产生，导致了AS结构的的破坏，引起AS斑块的破裂。试验结果表明山楂叶总黄酮治疗的大鼠的动脉血管结构较模型组显著好转，各治疗组的血清MCP-1和MMP-9蛋白水平和动脉组织中的mRNA表达量都较模型组减低，而TIMP-1水平较模型组升高，致使MMP-9/TIMP-1比值显著减低。实验结果说明，山楂叶总黄酮在治疗和预防AS中起到了阻止早期发生，扭转病情，减缓发展的作用，为临床治疗AS提供了一种较好的中药治疗选择。

参考文献：

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[4]刘健,李群芳,匡红英, 等. 血小板功能与动脉粥样硬化研究进展[J].黑龙江医药科学,2012, 35(3) :42-43

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[7]卢文婷，刘中柱.山楂叶总黄酮对糖尿病肾病大鼠肾脏中VEGF表达影响[J].黑龙江医药科学,2013, 36(3) :63-64

[8]Kowalski J,Okopien B,Madej A,et al.Effects of fenofibrate and simvastatin on plasma sICAM-1 and MCP-1 coneentrations inpatients with hyPerliPoProteinemia [J].Int J Clin Pharmacol Ther,2003,41:241-247

中图分类号：R285.6

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2015)06-0035-03

基金项目:①1.黑龙江省中医药科研项目,编号：ZHY12-Z200；2.黑龙江卫生厅科研课题，编号：2012-242；3.佳木斯大学科研项目，编号：S2010-104。

作者简介:高英英(1980～)女,黑龙江鸡西人,硕士,讲师。

通讯作者:马雷(1980～)男,黑龙江哈尔滨人,硕士,主管技师。E-mail:maleijms@163.com。

(收稿日期：2015-04-30)