康晓明，聂　晶，杨占双

(佳木斯大学附属第一医院儿内一科，黑龙江 佳木斯 154003)



NGAL在腺嘌呤大鼠肾纤维化中的表达①

康晓明，聂晶，杨占双

(佳木斯大学附属第一医院儿内一科，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要:目的：探讨NGAL在腺嘌呤致大鼠肾纤维化中的表达情况。方法：将48只Wistar雄性大鼠，随机分为2组。即正常组(n=24)、模型组(n=24)，模型组每天予以200mg/kg的腺嘌呤灌胃，正常组摄入等量的NS，连续灌胃6周，在第2、4、6周末将肾组织取出，通过HE染色观察病理改变，免疫组化染色观察大鼠肾组织中NGAL的表达情况，应用图像分析系统软件进行半定量分析。结果：正常组大鼠肾组织结构正常，模型组在第2周时表现管腔扩张，肾小管出现肿胀，肾间质有弥漫性炎性细胞浸润，间质出现纤维化，第4周时肾小管扩张更明显，肾间质仍有较多的炎性细胞浸润，肾间质纤维化较前明显，第6周时肾小管萎缩甚至有坏死，肾间质广泛纤维化。NGAL在正常对照组大鼠肾组织有少量的表达，尤其以肾小管表达为主，与正常组比较，模型组第2周时肾组织中NGAL的表达水平显著升高，有统计学意义(P<0.05)，第4、6周时NGAL的表达水平明显低于第2周。结论：NGAL在腺嘌呤所致大鼠肾纤维化的表达水平显著增高，与对照组比较差异显著，提示其可作为肾纤维化发展的指标，为临床上判断病情提供参考。

关键词：NGAL；肾纤维化； 表达水平

肾纤维化是各种各样的慢性肾脏疾病发展为末期肾病的共同通路，肾脏纤维化作为一种复杂的疾病，其潜在的分子机制尚不清楚，因此，探讨肾纤维化发展的分子机制对于肾脏疾病的治疗，保护残存肾脏功能意义重大[1~3]。研究表明NGAL在肾脏疾病的发生发展过程中起着重要的作用[4]。此外，最近报道的研究结果还表明，NGAL可能参与导致慢性肾疾病如多囊肾疾病和肾小球肾炎的病理生理过程[5]。NGAL水平与肾功能损害的严重程度明显相关，能表示损伤相关的慢性疾病的程度，但关于NGAL在肾纤维化组织中的表达情况尚未见报道。在此背景下，本研究通过建立大鼠肾脏纤维化模型，对其肾脏组织NGAL的表达情况及病理变化进行分析以探讨肾纤维化发展的分子机制，以期为临床更好的治疗肾脏系统疾病提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

DAB显色试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 )；免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)； 兔抗大鼠NGAL多克隆抗体(沈阳宝信有限公司)。

1.2实验动物分组及造模

将48只健康清洁的Wistar雄性大鼠随机分为2组，即正常组24只，模型组24只。模型制作参照相关文献[6]并加以改进，采用腺嘌呤200mg/kg灌胃连续6周，前15d每日灌胃，15d后采用隔日给药的方式，正常组给予等体积的生理盐水。

1.3组织标本收集、处理与测定

将两组大鼠处死前一天将其放入代谢笼中以收集24h尿液，收集的尿液与离心机离心后放入-70℃的冰箱中保存待测24h尿蛋白。分别于第2、4、6周末随机选取大鼠以40mg/kg的戊巴比妥纳腹腔注射麻醉后，将大鼠开腹开胸，迅速取出肾脏于4%的多聚甲醛溶液中固定，梯度脱水，从50%乙醇开始，经70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇进行逐步脱水，每次时间为30min，其中95%乙醇和无水乙醇进行两次脱水。再将肾组织先在无水乙醇：二甲苯=1：1的混合液中浸入20min，再于纯二甲苯中浸润10min，再重复浸入另一瓶二甲苯中浸10min进行适当的透明处理，再进行石蜡包埋，包埋过程中，石蜡应该保持在60℃以下。制成约厚度为3μm的切片进行HE和免疫组化染色。

1.4免疫组化结果判定

将NGAL的免疫组化染色的切片在光学显微镜下(×400)观察免疫组化的结果，染色呈棕黄色的为免疫组化结果阳性，取10个不包括肾小球并不重复的肾间质视野，应用病理图像分析系统对阳性结果进行图像分析，计算染色为阳性信号的平均积分光密度值(IOD),取平均值进行比较。

1.5统计学方法

2　结果

2.1两组大鼠肾组织病理学变化

正常组大鼠肾组织结构正常。与正常组比较，模型组在第2周时表现管腔扩张，肾小管出现肿胀，肾间质有弥漫性炎性细胞浸润，间质出现纤维化，第4周时肾小管扩张更明显，肾间质仍有较多的炎性细胞浸润，肾间质纤维化较前明显，第6周时肾小管萎缩甚至有坏死，肾间质广泛纤维化。

图1　正常组大鼠肾组织(HE×400)

图2　2周模型组肾组织病理变化(HE×400)

图3　4周模型组肾组织病理变化(HE×400)

图4　6周模型组肾组织病理变化(HE×400)

2.2各组大鼠肾组织NGAL的表达情况

NGAL在正常对照组大鼠肾组织有少量的表达，尤其以肾小管表达为主，与正常组比较，模型组第2周时肾组织中NGAL的表达水平显著升高，有统计学意义(P<0.05)，第4、6周时NGAL的表达水平明显低于第2周。

表1　各组大鼠肾组织NGAL表达情况

3　讨论

慢性肾脏疾病(CKD)发病机制主要是由于血流动力学和炎症过程的相互作用而致，最终会导致肾纤维化。同时肾脏病又是小儿时期的常见病，其病情反复或迁延会进入肾纤维化时期，严重影响患儿的身心健康。其病因多为感染性、免疫性、中毒性、代谢性等因素而导致。肾间质纤维化是以间质纤维化、肾小管萎缩及炎症细胞侵润为主要病理特征，其发病机制尚不明确，可能的因素为：肾小管上皮间充质转化，血管活性物质、细胞因子和炎症细胞，和细胞外基质的代谢失衡。肾间质纤维化的严重程度一直是被认定为最强的预测随后的进行性肾功能丧失[7]。肾间质纤维化是导致终末期肾病的慢性肾病的常见表现，此外，肾小管间质纤维化是梗阻性肾病的一种重要的结构成分，是导致儿童时期慢性肾病的主要原因，是渐进式的肾脏疾病常见的最后的结果，它导致重大破坏正常的肾脏结构和相应的功能变差。 早期纤维化的变化，仍可能是可逆的。NGAL是一个25kDa的蛋白质，是载脂蛋白家族的一员，于生理状态下存在人类组织中包括肾小管上皮细胞中，其表达浓度很低，与肾脏疾病有着密切的关系。最近，有研究报道，NGAL是作为预测肾损伤的早期的生物标志物。在炎症存在和上皮细胞受损时，包括肾缺血再灌注损伤和肾毒性NGAL的表达升高。 NGAL在炎症的反应过程中和在肿瘤的进展发挥了一定的作用，其对肾脏的功能起到有益的作用，能够灵敏、迅速的反映肾脏疾病的损伤和恢复的过程。近来越来越多的文献报道NGAL可能参与了肾间质纤维化过程，而且参与肾小管上皮细胞向间充质细胞转化，不但可以早期预测肾间质纤维化，同时能够维持肾小管上皮细胞的表型，阻止其向间质细胞转化。有研究报道，血和尿NGAL水平连续测量可以预测系统性红斑狼疮肾病的活动及恶化，血、尿中NGAL水平升高表明狼疮性肾病的恶化.于永刚[8]等人研究发现，NGAL在肾间质纤维化初期表达显著升高,随肾间质纤维化进展,NGAL表达水平明显降低。我们的研究结果与于永刚等人的研究结果一致，在肾间质纤维化的第2周时NGAL表达升高，第4周时表达降低，第6周时降低更为显著。出现这种结果的原因可能是大鼠机体在连续灌胃的第4周、6周逐渐适应了腺嘌呤灌胃的刺激而发生NGAL表达水平的降低，也有可能是机体存在一种自动的改善肾纤维化的机制，确切结果有待进一步研究证实。综合上述分析我们可以得出结论，NGAL在腺嘌呤所致大鼠肾纤维化的表达水平显著增高，与对照组比较差异显著，提示其可作为肾纤维化发展的指标，为临床上判断肾脏纤维化病情严重程度提供参考。

参考文献：

[1]徐小龙,刘丁,刘永光，等.慢性移植肾纤维化诊断的研究进展[J].广东医学, 2014,35(19):3094-3096

[2]李明亮,杜洁.肾纤维化信号通路的研究进展[J].医学综述, 2013, 19(18):3275-3278

[3]辛冰牧,杨红振,胡卓伟，等.肾纤维化发病机制及治疗学研究进展[J].国际药学研究杂志, 2008, 35(5):349-354

[4]曾慧勤(综述),张建江(审校).肾纤维化过程中表观遗传因素研究进展[J].国际儿科学杂志, 2014, (5): 538-541

[5]刘刚,于永刚,梁毅文,等.NGAL在肾间质纤维化不同阶段的表达及意义[J].浙江临床医学, 2010, 12(5):458-461

[6]刘建春，郑法雷，刘燕萍,等.褐藻多糖硫酸酯对腺嘌呤致大鼠肾间质纤维化的干预作用及其机制探讨[J].中国中西医结合肾病杂志，2008,9(2):100-103

[7]Liu Y.Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis[J]. Nat Rev Nephrol,2011, 7: 684-696

[8]Devarajan P, Mishra J, Supavekin S, et al. Gene expression in early ischemic renal injury: clues towards pathogenesis, biomarker discovery, and novel therapeutics[J].Molecular Genetics and Metabolism, 2003,80(4):36-37

[9]Schmidt-Ott KM, Mori K, Jau YL, et al. Dual action of neutrophil gelatinase-associated lipocalin[J].Journal of the American Society of Nephrology,2007,18(2):407-413

The expression of NGAL on renal interstitial fibrosis

KANGXiao-ming,NIEJing,YANGZhan-shuang

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Abstract：Objective：To evaluate the expression of NGAL in kidney tissue of rats with renal fibrosis. Methods: 48 male Wistar rats were randomly divided into 2 groups: the normal group (n=24) and model group (n=24). Rats in model group were given 200mg/kg adenine everyday, while normal group were given the same amount of NS. The renal tissue was removed on the 2th, 4th, 6th week. Then we observed the pathological changes by HE staining, and evaluated the the expression of NGAL by making a semi-quantitative analysis with an image analysis system software. Result: normal rat renal tissue structure was normal, compared with the normal group. Model group showed luminal dilatation at the second week , the renal tubular swelling, renal interstitial diffuse infiltration of inflammatory cells, interstitial fibrosis. The tubular dilatation was more obvious at the fourth week, renal interstitial still intensive inflammatory cell infiltration, renal interstitial fibrosis significantly. At the sixth week of tubular atrophy and necrosis, renal interstitial extensive fibrosis. NGAL in normal renal tissue of rats had a small amount of expression, particularly in the renal tubules, compared with the normal group. The expression levels of model group at the 2th week were significantly higher (P<0.05). At the 4th and 6th week, NGAL expression levels were significantly lower than those at tthe 2th week. Conclusion: NGAL expression levels in adenine-induced renal fibrosis in rats was significantly higher, and it may suggests that it can be used as indicators for the development of renal fibrosis, and it can provide a reference for judging the clinical condition.

Key words：NGAL; renal fibrosis ; expression levels

中图分类号：R692

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2015)06-000601

基金项目：①1.黑龙江省教育厅科技项目，编号：12541796；2.佳木斯大学科技项目，编号：S2010-79。

作者简介：康晓明(1962～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师。

(收稿日期：2015-06-06)