李凤元

（辽宁省重大动物疫病应急中心110161）

炭疽杆菌基因检测方法研究进展

李凤元

（辽宁省重大动物疫病应急中心110161）

近年来，动物炭疽病在我国北方地区夏季汛期时有发生。动物发生炭疽疫情时，要对疑似炭疽动物尽快进行确诊。另外，在疫情防控期间不可避免地对周围环境造成一定程度的污染，而最有可能污染土壤和水源。炭疽杆菌进入土壤就会形成芽孢，芽孢对恶劣环境具有极强的抵抗能力，可存活数十年。而进入水源后，极易污染水流流经的其他地区，使其成为新的潜在炭疽疫源地。当炭疽芽孢被摄入动物体内时会导致严重的菌血症，进而会不同程度的引发炭疽疫情。因此，及时有效的诊断，以及在使用有效消毒药物对周围环境进行消毒后对疫区土壤、水源的污染状况进行调查是十分必要的。本文介绍了针对炭疽杆菌基因检测方法的研究进展，为该病的诊断、环境污染监测、疫情防控提供技术依据。

炭疽杆菌；检测方法；研究进展；综述

炭疽是由炭疽杆菌 （Bacillus Anthrax）感染引起的一种人兽共患病。由于炭疽芽孢和细菌本身的性质，直接以其为靶标的检测技术在特异性、灵敏度等方面已难以获得突破性的进展。虽然应用比较复杂的仪器设备可能解决部分问题，但由此带来的复杂度及费用增加又难以避免[1]。在炭疽检测上，由于基因技术的发展使得针对基因检测方法已达到较为理想的效果，灵敏、高效是此类技术最大的优势，基因检测技术已经逐渐取代基于芽孢和细菌繁殖体的检测方法。现将炭疽杆菌基因检测技术的研究进展分别进行介绍。适合于针对环境中炭疽病原体以及感染动物的检测。

1 基因检测技术

1.1 PCR技术和探针技术

很多学者采用PCR技术对炭疽杆菌或芽孢进行检测，只要靶位合适，引物设计合理，就会获得良好的检测效果。荣光华等建立的实时定量PCR检测灵敏度可达到每个反应10～100个拷贝，利用12种相关菌株评价后获得100%特异性，对10份模拟污染标本和20份对照标本检测，所有污染标本均被检出，所有对照标本均为阴性[2]。曲识、史清海等采用TaqMan荧光探针技术，针对炭疽芽孢杆菌pXO1、pXO2质粒上的基因设计引物，建立了一种简便、快速、定量检测炭疽芽孢杆菌的PCR方法，可特异且灵敏地检测土壤标本中可疑目标菌，检测灵敏度可达 2.5×103cfu/早土壤[3，4]。 谭维国等分别针对炭疽杆菌capA基因和PA基因设计引物以及荧光双标记探针，通过优化探针、引物浓度、反应体系试剂组分等参数，建立了可同时检测capA基因和PA基因的双重实时荧光PCR方法，其检测灵敏度分别可达到每个反应5和50拷贝，且具有良好的特异性[5]。赵婷婷等建立了一种简便的新型交叉引物恒温核酸扩增结合层析试纸条方法，可以快速可视化检测炭疽芽胞杆菌核酸。该方法是通过序列比对挑选出炭疽芽胞杆菌质粒上的特异性基因pXO2，设计引物、探针并合成标记，建立核酸恒温扩增反应体系，用金标免疫层析试纸条快速检测扩增产物。用建立的检测方法检测炭疽Sterne疫苗株的灵敏度为6×103cfu/ml，且与枯草芽胞杆菌、矮小芽胞杆菌、蕈状芽胞杆菌等相似菌株无交叉反应，具有良好的敏感性和特异性[6]。

1.2 LAMP技术

华南农业大学农学院李亭潞等人曾针对荔枝炭疽病菌的GS基因序列设计了LAMP特异性引物，通过条件优化建立了检测荔枝炭疽病菌的LAMP体系，通过检测结果表明，LAMP引物特异性较好，能准确地从样品中检测出炭疽菌， 检测灵敏度为 100f早/μl， 分别高于常规PCR检测方法的100倍和10000倍[7]。 Ben Hatano等将LAMP技术应用于炭疽杆菌的检测，在一个反应体系内 （25ul）能够检测大约1000个拷贝。虽然存在污染的可能性，但其极高的敏感性和特异性显示了该项技术在检测炭疽杆菌上的潜力[8]。

1.3 芯片技术

文海燕等针对炭疽芽孢杆菌、布鲁菌、类鼻疽伯克霍尔德菌等5种生物恐怖细菌的特异性基因序列设计了6对引物和相应特异性探针，经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段，标记的PCR产物与包被在不同编码微球上的相应探针杂交，用悬浮芯片扫描仪检测其监测体系特异性好、灵敏度高，可以将炭疽芽孢杆菌作为检测目标之一[9]。王静等建立了基于双抗体夹心免疫学检测的编码微球悬浮芯片方法，对炭疽杆菌芽孢检测最低检出限为4.2×103cfu/ml，动态范围为103～107cfu/ml，该方法具有很好的敏感性和特异性[10]。

2 小结及展望

基于基因检测技术在检测炭疽杆菌上具有简便、快捷、灵敏度高和特异性好等特点，在炭疽杆菌检测方法的研究中，作为临床诊断、环境污染监测、疫情防控等方面快速检出炭疽杆菌的重要手段，基于基因的检测技术将会进一步受到重视和得到发展。

[1]刘炬,徐俊杰,陈薇,等.炭疽杆菌检测方法的研究现状与展望 [J].微生物学报,2012,52(7):810-815.

[2]荣光华,夏懿,朱诗应,等.炭疽芽胞杆菌染色体特异序列的筛选及实时定量检测[J].微生物学报,2006,46(6):900-905.

[3]曲识,史清海,何宁.定量PCR快速检测炭疽芽孢杆菌的实验研究[J].军事医学科学院院刊,2010,34(3):275-279.

[4]史清海.土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢杆菌定量PCR检测技术的研究[D].史清海,2010.

[5]谭维国,陈文琦,吕恒,等.炭疽杆菌双重实时荧光PCR检测方法的建立[J].东南国防医药,2013,15(6):556-559.

[6]赵婷婷,孙文铮,杨宇,等.CPA恒温扩增技术检测炭疽芽胞杆菌方法的建立 [J].中国国境卫生检疫杂志,2014,37(4):247-250.

[7]李亭潞,司徒俊键,江立群,等.荔枝霜疫霉和荔枝炭疽菌LAMP检测技术的建立[J].中国菌物学会2015年学术年会论文摘要集,2015.

[8]HatanoB,MakiT,ObaraT,et al.LAMP Using a Disposable Pocket Warmer for Anthrax Detection,a Highly Mobile and Reliable Method for Anti-Bioterrorism[J].Japanese Journalof Infectious Diseases,2010,63:36-40.

[9]文海燕,王静,刘衡川,等.五种生物恐怖细菌基因悬浮芯片多重检测方法的建立[J].四川大学学报(医学版),2009,40(2):325-329.

[10]王静,杨赟韵,乔舜,等.悬浮芯片法与生物素-亲和素ELISA法检测炭疽杆菌芽孢比较研究[J].中国国境卫生检疫杂志,2009,32(6):436-440.