张洪欣，马瑞敏，张国军，康熙雄



胶质瘤预后相关分子标志物的研究进展

张洪欣，马瑞敏，张国军，康熙雄

作者单位：100050 北京，首都医科大学附属北京天坛医院/北京市免疫试剂临床工程技术研究中心

神经胶质瘤，是原发于中枢神经系统的一类最常见的肿瘤。尽管在过去的几十年中，神经胶质瘤的治疗已有很大进展，但是大多数患者的临床结局仍然很差，尤其是胶质母细胞瘤（GBM），中位生存期只有 14.6 个月，经过及时、有效的治疗，只有 5% ～ 10% 的患者生存期可以达到两年[1]。

近年来，手术联合放疗和替硝唑胺化疗已经成为胶质母细胞瘤的标准治疗方案[2]，但是即使接受相同的治疗，患者的生存期也明显不同。生存期受很多因素影响，包括治疗策略、患者的身体状态、肿瘤的特征等。和这些因素相关的标志物往往是胶质瘤患者预后评价的关键，针对相关标志物的靶向治疗将成为未来胶质瘤治疗方面的重大突破，并对患者的生存期和生活质量产生重大影响，现就其在胶质瘤中的表达对预后的影响作一综述。

1　受体酪氨酸激酶及 ppENK、MGMT 启动子甲基化

1.1EphA2 及 ephrinA1

受体酪氨酸激酶（RTKs）作为跨膜细胞表面受体超家族，可通过调节第二信使的产生和基因转录，调控细胞增殖和存活。肝细胞性促红细胞生成素（Eph）作为 RTKs 中最大的一个亚群，包括至少 16 个成员，调节细胞间相互作用、细胞迁移、中枢神经系统发育、肿瘤血管生成等过程。由于结构和配体选择的不同，分为 A 和 B 亚型。EphA2 是EphA 的主要成员，epha 基因最早由 HeLa cDNA 文库克隆而成，定位于染色体 1p36.1[3]，有研究证实，EphA2 在成年上皮细胞中低度表达，负责调控细胞增殖和迁移。相比之下，EphA2 在上皮起源的恶性肿瘤高度表达，可能参与肿瘤细胞的增殖、侵袭和凋亡。EphrinA1 作为 EphA2 的主要配体，可能通过调控 EphA2 的表达诱导肿瘤恶性表型改变。有研究发现，Eph 受体/ephrin（配体）系统的下调与肿瘤的形成、生长、转移以及血管的生成密切相关[4]。值得注意的是，EphA2 受体在许多上皮恶性肿瘤和 hGBMs 中过度表达[5]。

Liu 等[6]提出 EphrinA1 的表达可能通过降低 EphA2的表达和下调 FAK 而削弱人脑胶质瘤 U251 细胞的增殖、迁移、黏附、生长。虽然许多研究表明在许多肿瘤中EphA2 高表达，而 EphrinA1 低表达，提示 EphA2 是EphrinA1 的负调节剂，但证据尚不足[7]。Li 等[8]的研究发现，在 GBM 细胞中 EphA2 的敲除会抑制 EphrinA1 的表达。

最近的研究已经证实 hGBM 细胞亚群的存在，它具有干细胞特性和肿瘤的形成及蔓延能力，被称为肿瘤蔓延细胞（TPCs）[9]。Binda 等[10]对 12 个 hGBM 样本进行分析，发现 EphA2 表达相对于其他 EphA 和 EphB 受体明显升高，实时 PCR 显示，EphA2 mRNA 水平在 hGBM 中相比于正常人脑组织明显增高，证明了在 hGBM 中，TPCs 过度表达 EphA2，用于支持其未分化状态，维持其自我更新的致瘤性，EphA2 促进 TPCs 的干细胞潜力和肿瘤传播能力。持续的颅内 EphrinA1-Fc 的输注以及 siRNA 介导的EphA2 的敲除都会导致 TPCs 自我更新的丧失和诱导分化。基于以上研究，在恶性胶质瘤中 EphA2 和 EphrinA1表达之间存在双向调制，因此可将 EphA2 和 EphrinA1 共同用于评估胶质瘤患者的预后。

1.2ppENK 启动子的甲基化

前脑啡肽原（preproenkephalin，ppENK）位于染色体8q23-24，其编码的 met-enkephalin 是一种阿片样生长因子的前体，又是一种抑制因子，能够抑制肿瘤生长、细胞更新、生长发育、伤口愈合和血管生成。其产物阿片类生长因子通过与阿片类生长因子受体结合发挥作用，能够在体内和体外条件下抑制肿瘤生长[11-12]。目前主要在胰腺腺癌、胰管内乳头状黏液瘤和胰腺导管上皮肿瘤中发现了 ppENK 的甲基化失活[13]。

采用巢式聚合酶链反应（nPCR）和亚硫酸氢盐修饰后测序法（BSP）检测胶质瘤组织和正常脑组织中 ppENK 基因启动子区 CpG 岛的甲基化状态，结果表明，ppENK 基因启动子区 CpG 岛的异常甲基化在胶质瘤组织中具有肿瘤特异性，与胶质瘤病理分级有关，是胶质瘤发生、发展过程中的中晚期事件。目前已经有研究发现 p16、hMLH1、SLCSA8 等相关基因启动子区域 CpG 岛的异常甲基化与脑胶质瘤病理分级密切相关，其甲基化率随着脑胶质瘤恶性程度增加而增高，ppENK 甲基化率在不同级别脑胶质瘤中同样存在这一变化趋势，ppENK 基因启动子区域 CpG 岛的甲基化有可能成为脑胶质瘤评价恶性程度和预后的生物学标记[14]。

1.3MGMT 启动子甲基化

烷化剂作为一种常见的化疗药，主要通过给肿瘤细胞DNA 加入毒性的加合物，导致 DNA 交联，DNA 不能复制，致使肿瘤细胞死亡，胶质瘤的分子标记物 DNA 修复蛋白 O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（MGMT）是研究广泛的化学耐药的机制之一。MGMT 基因启动子甲基化是近年研究较多的胶质瘤相关分子标记物，除了对烷化剂化疗敏感性的预测价值外，它们在胶质瘤中的预后价值已经得到肯定。具体作用机制如下：以直接损伤逆转路径，只需一步反应就能将 O6-AG 上的烷化基团共价转移到自身的半胱氨酸活性位点上，使 DNA 上损伤的鸟嘌呤复原，甲基化的MGMT 蛋白失去活性，随后从 DNA 上释放下来，通过泛素化路径降解，而不能重新脱甲基化以恢复活性[15]。

MGMT 基因启动子甲基化可以直接影响 MGMT 蛋白的表达，MGMT 启动子甲基化多发生于基因启动子的CpG 岛，也是 MGMT 基因最常见的改变。MGMT 启动子甲基化已经在很多恶性肿瘤中发生，如肺癌、食管癌、乳腺癌、结肠癌、宫颈癌[16]等。在既往的脑胶质瘤研究中发现，胶质瘤患者的 MGMT 基因启动子甲基化程度越高，患者的化疗效果越差，患者的生存时间也越短，说明 MGMT 对于胶质瘤患者的预后和生存期有明显的预测作用。

1.4端粒酶逆转录酶基因启动子突变

端粒酶逆转录酶（TERE）基因位于染色体 5p15.33，长 40 kb，启动子区长 11.2 kb，起始点上游是转录核心区域，启动子突变后形成特殊序列，含有 ETS 转录调节因子结合位点，促使 TERT 表达的上调，激活端粒酶，维持端粒长度、结构，保护染色体的完整性，实现肿瘤的不断增殖。

Killela 等[17]发现该突变主要发生在原发性胶质母细胞瘤和少突胶质细胞瘤中。进一步研究发现，突变位点在C228T 和 C250T，该位点不存在核苷酸多态现象。何洁等[18]通过研究发现，突变型患者的术后生存时间明显短于野生型，在低级别组和高级别组中均与不良预后相关，表明对TRET 启动子突变进行及时干预对于患者临床转归及预后的重要性。

1.5异柠檬酸脱氢酶突变

异柠檬酸脱氢酶（IDH）有三种同工酶，IDH1和 IDH2被证明与肿瘤相关，研究较为成熟的是 IDH1。IDH1 位于2q33.3，全长 18 841 bp，基因突变主要发生于外显子 4 上第 132 个氨基酸位点[19]，该处为 IDH1 的活性位点，突变导致其活性的降低，降低代谢产物，从而抑制肿瘤细胞的大量增殖。

研究发现，IDH 基因突变主要发生于高级别胶质母细胞瘤中[20]。IDH1 基因突变是胶质瘤患者预后的关键因素，突变型患者较野生型对化疗药物更敏感，患者的生存期明显延长。

1.61p/19q 共缺失

1 号染色体短臂（1p）和 19 号染色体长臂（19q）共缺失是少突胶质细胞瘤的分子指标，有研究发现 1p/19q 缺失的少突胶质细胞对化疗敏感且中位生存期较未缺失者明显延长。

孙浩和李卫[21]通过荧光杂交检测 1p/19q 缺失情况，同时通过免疫组化检测 Ki-67（一种细胞增殖核抗原，定位于10 号染色体）的表达，发现两者显著相关，在Ki-67 高表达的细胞中，很少发生 1p/19q 的共缺失，两者可以共同检测指导患者的不良预后。

Eckel-Passow 等[22]根据 TERT 启动子突变、IDH 突变、1p/19q共缺失三项指标将胶质瘤患者分为 5 组进行分析，发现单纯 TERT 突变患者的生存期明显短于其他患者，三重阴性组的患者总体生存期明显短于 TERT 和 IDH 双重突变组或三重阳性组，在 IV 级胶质瘤中，单因素分析显示三项指标不同组合与总体生存期相关，但是多因素分析未发现独立相关性，从而证明分子病理指标在对临床预后判断的重要性。

2　新近发现的临床更易检测的分子标记物

2.1血清白蛋白

血清白蛋白由肝脏合成，是血清中主要的蛋白质成分，在维持血浆胶体渗透压、物质代谢、营养等方面发挥重要作用。作为患者营养状况指标之一，术前血清白蛋白水平与胶质瘤患者的生存期相关，患者的白蛋白水平偏高，往往能耐受放、化疗等标准辅助治疗方案，不会发生低蛋白血症，总的生存期延长。尽管白蛋白与前蛋白、总蛋白水平和淋巴细胞计数相关，并协同反映患者的营养状况，但多因素分析发现，血清白蛋白对于患者的预后评价更有帮助，考虑与其参与炎症反应相关。之前有研究表明，胰岛素样生长因子结合蛋白-2（IGFBP-2）与胶质瘤患者的生存期呈负相关[23]，具体机制是由于血脑屏障破坏，外源性 IGFBP-2 在脑内高浓度聚集，通过整合素 β1-ERK 途径刺激胶质瘤细胞增殖、侵袭和对替硝唑胺的耐受[24]。最新研究发现，在许多病理生理过程中，低血白蛋白与高 IGFBP-2 明显相关[25]，高IGFBP-2 加速 IL-6（通常增加分解代谢，抑制肝脏合成）的生成，使患者的营养状况变差。因此，白蛋白、IGFBP-2、IL-6 之间的相互作用明显影响患者的临床结局，从而导致患者的预后不良。

2.2上皮水解素

上皮水解素（MMP-28）是最新发现的基质金属蛋白酶（MMPs）成员，克隆自人的角化上皮和睾丸的 cDNA 文库[26]，在正常组织如睾丸、肺、心脏和胃肠道中表达，但相应组织中的具体细胞尚不明确[27]。有研究表明，它能诱导 TGF-β 参与的上皮间质转化和细胞侵袭过程[28]，而细胞内外研究证实，TGF-β 介导的上皮间质转化参与恶性胶质瘤 GBM 的进展[29]，因此，MMP-28 可能参与胶质瘤的进展。Wang 等[30]采用免疫组化染色技术测定不同组织中MMP-28 蛋白的表达，胶质瘤组织中的表达明显高于正常组织，推测 MMP-28 具有致瘤作用。采用单、多变量分析发现，MMP-28 的表达是胶质瘤患者总生存期的独立危险因素，与患者的年龄、KPS 评分、切除范围、MGMT 启动子甲基化、IDH1/2 突变共同参与恶性胶质瘤患者的预后评价和临床结局。

2.3组蛋白脱乙酰基酶类

染色体不稳定性（CIN）是癌症的特点，与肿瘤的发生密切相关。作为基因组不稳定的一个主要形式，CIN 在肿瘤形成的早期阶段起关键作用，当各种形式复合存在时，会导致正常细胞转化为癌细胞[31]。CIN 各种形式在癌症中已有发现，包括突变、杂合性的缺失、拷贝数量的改变等。CIN 可影响化疗的敏感性，从而影响患者的预后[32]。

组蛋白脱乙酰基酶类（HDACs）调控染色体结构，与癌症细胞中染色体完整性的丢失相关。HDACs 是组蛋白乙酰化的主要调控者，有研究表明，CIN 和组蛋白乙酰化之间明显相关，组蛋白乙酰化的核心是 HDACs，它通过靶向组蛋白和非组蛋白，来维持基因组的完整性，由此调控DNA 的修复机制[27]。18 组人类 HDACs 被划分为四类，作为 II 型 HDACs 之一，HDAC4 和许多疾病过程密切相关，包括癌症、白血病、糖尿病、感染和心脏病，它在脑中也高度表达，参与脑部各种功能，包括学习和记忆、行为、神经元的长久存活等[33]。

一些研究已经证实 HDAC4 在癌细胞中的各种角色。在软骨肉瘤中，HDAC4 表达水平的下降会导致血管内皮生长因子表达的上调，从而刺激血管的生成[34]。在前列腺癌细胞中，HDAC4 的下调和高水平雄激素受体（促进细胞增殖）的表达相关[35]。Cheng 等[36]选取 529 例胶质瘤患者分组进行研究，发现 HDAC4 的表达在不同级别胶质瘤中表达不同，级别越高，表达越低。同样级别越高，CIN 的评分越高。通过进行基因集富集分析（GSEA）发现，HDAC4的表达在功能上与染色体结构的维持密切相关。综合提示CIN 通过 HDAC4 反映基因表达与胶质瘤的密切关系。根据 HDAC4 表达水平进行分组，生存分析显示 HDAC4 的过度表达意味着总生存期的延长和疾病进展的延迟。

几项研究已经表明，MGMT 启动子甲基化所致MGMT 的缺失可提高烷化剂的敏感度，但是一些胶质瘤患者 MGMT 启动子甲基化仍然表现对这些药物的耐受性，因此，评估基因组完整性联合 MGMT 启动子甲基化可以对耐药机制有更深的理解。MGMT 启动子甲基化的 GBM 患者接受放化疗联合分析显示 CIN 评分低，患者的生存期延长，而 CIN 评分高的组分患者的临床结局往往较差。这些结果表明，MGMT 启动子甲基化导致的对化疗的敏感性依赖于稳定基因组的存在，根据基因的不稳定程度可将MGMT 启动子甲基化的患者进行明确分级。基于上述HDAC4 表达与 CIN 之间的紧密相关，MGMT 启动子甲基化联合 HDACA 的表达用于评估患者的临床结局。有趣的是，对于高度恶性的 GBM，MGMT 启动子甲基化、HDAC4 高表达（暗示低级别 CIN）联合放疗能最大程度地受益。因此，综合两者可以确保患者预后良好以及获得最有效的治疗效果[37]。

2.4Smad4

Smad 蛋白参与转化生长因子-β（TGF-β）超家族信号从细胞表面到细胞核的转移。Smad4 是 Smad 蛋白家族中第二类通用调节 Smad，它最初在胰腺导管腺癌中发现作为肿瘤抑制基因定位于 18q21.1 染色体上，是 TGF-β-Smad信号通路的主要调解者，抑制上皮细胞的增殖[38]。细胞内外研究已经发现，定位于 18q21 染色体的 Smad4 基因的突变在肿瘤生成和胰腺癌、前列腺癌、大肠癌等实体瘤的进展中起关键作用。

Zurawel 等[39]在神经胶质瘤 DNA 样本中进行调查，在髓质母细胞瘤中没有发现 Smad4 基因的突变。Yang 等[40]通过将重组腺病毒编码 Smad4 基因转入 U251 细胞株上，采用蛋白质印迹技术监测细胞的增殖及凋亡情况，结果显示，Smad4 基因的过度表达增加 G0/G1 期细胞的比例，并能下调细胞周期蛋白 D1 和上调 P27 的表达，将细胞周期阻滞在 G1 期，抑制细胞增殖。另外，Smad4 的过度表达促进胶质瘤细胞的凋亡，总之，Smad4 基因在胶质瘤细胞中具有抑制增殖的能力，可以作为未来胶质瘤治疗的一个新的靶点，明确改善患者的预后和增加患者的生存期。

3　microRNA 中与胶质瘤预后相关标志物

3.1miR-210

miR-210 的茎环结构序列位于由 11p15.5 染色体上AK123483基因转录生成的非编码 RNA 的内含子内，随着miRNA 研究的不断进展，miR-210 是目前一致公认的在乏氧的正常或肿瘤细胞中表达变化最显著的 miRNA，在生理状态下及恶性肿瘤环境中对乏氧细胞的增殖、凋亡、血管生成、DNA 损伤修复和能量代谢起重要作用[41]。miR-210 在肿瘤中的表达通常是升高的，例如黑色素瘤、肾透明细胞癌、胰腺癌[42]和乳腺癌[43]。Lai 等[44]通过采用实时定量 PCR 等技术证实胶质瘤肿瘤微环境的主要特点是缺氧，乏氧诱导因子（HIF-1）是低氧诱导结合蛋白，是由 1 个对氧分压敏感的 α 亚基（HIF-1α）和一个组成性的 β 亚基（HIF-1β）构成的异二聚体，可调控细胞周期进程相关基因的表达。HIF-1发挥作用主要由 HIF-1α 亚基的表达和活性决定的，miR-210 受 HIF-1α 的调控，HIF-1α 在接近 miR-210 启动子处直接与转录起始点上游大约 40 bp 的乏氧反应元件（hypoxia responsive element，HRE）结合。作为 HIF-1α 靶基因的 miR-210 能够提高间充质干细胞（MSCs）在缺血、缺氧和再氧合预处理时的生存能力。缺氧是抑制干细胞分化的重要环境因子，miR-210 在细胞缺氧条件下可通过抑制诱导性多能性干细胞（iPS）死亡来加强体细胞基因重排。鉴于 miR-210 的表达与乏氧的密切关系，血液循环中miR-210 水平有可能成为胶质瘤患者的预后指标。另外，在胶质瘤中，miR-210 的过度表达与低功能状态（KPS）评分、高病理级别，无疾病进展时间（PFS）和总生存期（OS）缩短相一致，适于术后预后的分析评价。

3.2miR-200b

miR-200b 定位于染色体 1p36，可以调节转录因子 Zeb-1 和Ets-1，以及 Suz12（一种转录抑制因子复合物的亚基）。最近的研究表明，miR-200b 在大部分癌症中起抑制作用，如胃癌、胰腺癌、大肠癌、乳腺癌和子宫内膜癌等[45]。miR-200b 可调控上皮间质转化、化疗敏感性和细胞的增殖。有研究表明，miR-200b 的下调伴随着 EMT 的诱导者Zeb-1 和 Zeb-2 的上调，与癌细胞的间质和药物抵抗表型高度相关[46]。在胶质瘤中，miR-200b 靶向 CREB1 基因，抑制体内肿瘤细胞的生长。

Men 等[47]采用实时定量 PCR 对胶质瘤患者和正常组织 miR-200b 的表达进行检测，显示胶质瘤组织中miR-200b的表达较正常组织下调，而且下调的程度依赖于胶质瘤的病理级别，级别越高、KPS 评分越低，miR-200b 的表达越低。生存分析显示，miR-200b 的异常表达与低级别的胶质瘤（I 级和 II 级）患者的预后无明显相关，可能与低级别的胶质瘤复发率和死亡率较低有关，因此在高级别胶质瘤（III 级和 IV 级）中评价 miR-200b 的预后价值更有意义。更重要的是，当依据 miR-200b 对恶性胶质瘤进行分层时，miR-200b 表达低的患者的无进展生存期和总生存期明显缩短，提示 miR-200b 是监测胶质瘤患者预后的独立因素。

3.3miR-33a

miR-33a 基因位于甾醇调控元件结合蛋白（SREBP）基因的内含子区，具有调控胆固醇及脂肪酸代谢作用。Cirera-Salinas 等[48]的研究发现，过表达 miR-33a 可抑制CDK6 和 cyclinDl mRNA 的表达，抑制细胞增殖。使细胞周期抑制在 G1 期。Fuster 和Andrés[49]报道 miR-33 可结合 P53 mRNA 的 3'UTR 区，抑制 P53 基因表达，在造血干细胞中可观察到细胞高表达 miR-33，抑制P53水平，并影响造血干细胞的自我更新能力。

胶质母细胞瘤是恶性程度最高的原发性脑肿瘤，大多数生存期不到一年，其组织内表现明显的异质性，包含一个细胞亚群即肿瘤起始细胞（TIC）又称癌症干细胞或胶质瘤起始细胞（GICs）[50]，具有明显的致瘤作用，能自我更新，能诱导 CD133、转录因子巢蛋白和少突胶质细胞转录因子-2（OLIG2）的表达，能分化为多种谱系，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[51]。有研究证实，GICs 能抗放、化疗，从而介导胶质瘤的不断复发[52-53]。

Wang 等[54]证实了 miR-33a 在胶质瘤中对肿瘤干细胞的作用，即促进干细胞的增殖和自我更新，具体机制如下：CD133 是公认的脑肿瘤干细胞标志物，在高级别星形胶质细胞瘤的大量肥胖细胞中阳性表达显著，而含肥胖细胞成分的胶质瘤预后不良。GICs 具有干细胞特性，CD133 阳性表达，miR-33a 维持 GICs 的生长和自我更新。miR-33a 的过度表达促进 CD133 阴性的非胶质瘤起始细胞（non-GICs）表现干细胞的特性，同时促进神经球的形成和干细胞标志物（nestin、OLIG2、BMI1）表达的增加和颅内肿瘤的形成。GICs 生物特性的维持需要 miR-33a，miR-33a 主要是通过调控 PKA 和 Notch 信号通路得以实现。

在 PKA 通路中，miR-33a 通过抑制它的直接靶点PDE8A 促进CD133 阳性的 GICs 的自我更新，从而增强PKA 通路的活动。而在 Notch 信号通路中，在 CD133 阳性的 GICs 中，miR-33a 表达下降，miR-33a 通过抑制它的直接靶点 UVRAG 促进 CD133 阳性的 GICs 的自我更新。miR-33a 介导的信号通路对于胶质瘤的进展是至关重要的，靶向细胞信号网络可以是未来 GBM 治疗的趋势，对于胶质瘤的预后评估也具有重要的意义。

4　结语

随着研究的不断深入，胶质瘤的诊断和治疗不仅仅局限于传统的学术指南，越来越多的研究倾向于基因和分子靶向治疗，通过特异性作用于发病的特定阶段，遏制疾病的进展，从而延长患者寿命并提高患者生存质量是胶质瘤患者预后的终极目标，然而胶质瘤的恶性程度及患者发病的异质性，决定了胶质瘤患者的预后不良。因此，寻找特异性的分子标记物，采取特异及个体化的治疗方案，成为未来胶质瘤研究的主导方向，并对胶质瘤患者预后的改善具有显著影响。

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收稿日期：2015-10-28

通信作者：康熙雄，Email：kangxx@vip.sina.com

基金项目：北京市自然科学基金（7154193）

DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.01.012