王灵敏，孟小莽，许豫南，孟宇辰

（1.石家庄市种子管理站，河北 石家庄 050051；2.东北林业大学国家生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

浅议种子真实性与品种纯度鉴定方法的适用范围与优劣

王灵敏1，孟小莽1，许豫南1，孟宇辰2

（1.石家庄市种子管理站，河北 石家庄 050051；2.东北林业大学国家生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

在鉴定品种纯度时，根据不同品种采用不同方法进行真实性鉴定，对种子的鉴定工作可以起到事半功倍的效果。笔者总结了形态鉴定法、电泳法以及分子标记法等几种鉴定种子纯度的方法及适用范围，并总结了各方法的优劣，供同行参考借鉴。

种子；纯度鉴定

品种纯度与真实性是农作物种子质量重要指标之一，品种纯度的高低和种子的真假直接影响农作物的产量和品质。

品种纯度与种子真实性鉴定的方法目前有形态鉴定法、生理生化法以及DNA分子标记法。不同作物、不同品种通过选择适合的方法，可以做到简单、经济、快速又准确。

1 形态鉴定法

形态鉴定法包括种子形态鉴定法、种苗形态鉴定法和植株鉴定法几种。

1.1 种子形态鉴定法

根据种子形状、大小、颜色、质地及种子外表各部位的特征，鉴别本品种与异品种。如玉米种子可以根据粒型（马齿型、半马齿型、硬粒型）、粒色（白色、黄色、红色、紫色），籽粒的顶部形状（长方、长圆、圆），顶部颜色以及粉质的多少，胚的大小、形状，胚部皱折的有无、多少，花丝遗迹的位置与明显程度，稃色、籽粒棱角的有无及明显程度等进行鉴定。

一些玉米杂交品种存在胚乳直感现象，可以用此法鉴别自交粒和杂交种。该法简单、经济、快速，但用于鉴定品种纯度的特征有限，而且适用于形态性状丰富且易观察的作物品种，并且种子的大小、颜色易受成熟度、土壤和气候的影响，且受主观影响较大，故准确性较差，可酌情使用。

1.2 种苗形态鉴定法

根据不同品种幼苗的独特性状进行鉴定。如玉米芽鞘颜色分为紫色和绿色，用此性状只适用于鉴别芽鞘颜色不同的玉米品种。该法简便、省时，但仅适用于十字花科、豆科等幼苗形态性状丰富的有限几种作物，而且苗期所依据的性状有限，受环境的影响颇大，测定结果不太准确。

1.3 植株形态鉴定法

即田间小区种植鉴定法。田间小区种植鉴定法是鉴定品种真实性和测定品种纯度的最为可靠、准确的方法之一。

为了鉴定品种真实性，应在鉴定的各个阶段与标准样品进行比较，而且为使品种特征特性充分表现，在试验设计和布局上要选择气候环境条件适宜、土壤均匀、肥力一致、前茬无同类作物和杂草的地块，并有适宜的栽培管理措施。种植株数要根据种子质量标准而定，若标准为（N－1）×100%／N，种植株数应为4N。

通常根据品种审定公告中描述的特征特性，在苗期、花期、成熟期3个时期进行鉴定，尤其在特征特性表现最明显时期必须逐株鉴定。如玉米种子必须在花期根据株型、株高、叶色、花丝花药颜色、雄穗分枝等特征特性鉴定。

因依据的性状较多，是以前最为通用且比较可靠的方法，但要求有适宜的光照、温度等气候环境条件，如玉米要采用冬季的海南种植鉴定，此法受地域的限制，或者采用当地的同期种植鉴定（当年所生产的种子要等下一个生长季节才能鉴定），需时较长，种子下地前不能鉴定种子优劣。

同时，要求检验员拥有丰富的经验，熟悉被检品种的特征特性，能正确鉴别植株是属于本品种还是变异株，并能区分变异株是遗传变异，而不是受环境影响所引起的变异。

另外，如果遭遇冰雹、大风、过热过冷极端天气及长期多阴雨天气难以保证植株正常生长，就谈不上鉴定准确。

目前一些作物骨干亲本的集中频繁使用，使育成品种间的遗传差异越来越小，形态性状检验越来越困难。电泳技术和DNA分子标记技术的应用，恰恰弥补了形态法的不足。

2 电泳法

电泳法中常用的技术有同工酶电泳技术和蛋白质电泳技术。

2.1 同工酶电泳法

利用电泳技术分离各种酶的同工酶，通过比较同工酶谱，鉴定种子纯度。此法能分析大量样品，较简单、快速、可靠，不受环境影响。

但是，同工酶具有组织特异性、可利用的数量少、多态性少，对酶的提取要求高和电泳条件较为严格，还常因同工酶选择不当、同工酶活性及表达易随种子的贮藏和萌发过程发生变化等因素，影响鉴定结果的准确性，并且因酶易失活，难以大范围推广。

2.2 蛋白质电泳法

主要包括盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳和超薄等电聚焦电泳。禾谷类根据种子醇溶蛋白的多样性，形成电泳图谱差异加以鉴别。该方法品种间谱带差异较为明显，互补带清晰、分辨率高，提取和染色时间较短，简单、经济，稳定性、重复性好，在品种相对少的时期，为鉴定种子真实性和品种纯度发挥了相对准确、较为快速的优势，但对亲缘关系较近的品种难以鉴别。

醋酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定玉米种子的纯度，不需要用缓冲液配制分离胶和浓缩胶，简化了操作步骤，并且其样品提取和电泳时间都比较短，但是也有其局限性，如谱带弯曲、界限不太清晰等。

超薄等电聚焦电泳技术采用水平平板电泳槽，凝胶超薄、双聚焦，大大增加了点样数量，操作方便、准确性高、制胶速度快，缩短了固定、染色和脱色时间，但是电泳所用的两性电解质价格较贵。

同工酶电泳技术和蛋白质电泳技术具有快速、准确性高、重复性好的优点。但其毕竟是基因产物，势必会受到各种环境因素的影响，而影响鉴定结果的准确性。

3 分子标记法

分子技术主要有RFLP技术、RAPD技术、AFLP技术、SSR技术以及新兴的SNP技术。

3.1 RFLP技术

利用限制性内切酶切割不同品种的DNA时，产生DNA片段的数目和大小不同，通过电泳再进行Southern转移到膜上，利用放射性同位素，用该探针与支持膜上的DNA杂交得到DNA的限制性片段，多态性加以区分。

RFLP标记大多数为共显性，多态性稳定、特异性强、准确性高，但其过程繁琐、周期长、操作难度较大，需要大量纯度较高的DNA，耗费高，且放射性同位素的使用影响人体安全。这些缺点限制了其推广应用。

3.2 RAPD技术

利用随机引物对不同品种的基因组DNA进行PCR扩增、电泳，得到多态性DNA谱带进行鉴定。此技术反应灵敏、多态性强、分辨率高、快速简便、无放射性污染、DNA用量极少、成本较低，既有大量的随机引物可供筛选之用，又不受种属的限制。

但RAPD技术存在提供的信息不够全、一般为显性标记、不能区分杂合子与纯合子、不同引物之间的扩增结果重复性和稳定性相差较大、引物筛选工作量大等不足，有一定的局限性。

3.3 AFLP技术

利用基因组DNA经酶切后形成大小不等的随机限制性DNA片段，片段两端连接上与酶切位点配对的特定接头，用与接头互补的专用引物进行PCR扩增、电泳、放射自显影显示DNA指纹。

AFLP是RFLP和PCR技术的结合，兼备RFLP的可靠性和PCR的高效性。但AFLP多态性检出率过高，能检出样本内个体之间细微的差异，易形成假杂株，而且对DNA和内切酶的质量要求较高，实验技能高和仪器设备精密，操作复杂，试验周期长，加之是专利技术，不宜普及推广。

3.4 SSR技术

根据SSR序列两端保守的单拷贝序列，设计特异的引物，通过PCR扩增、电泳，得知不同个体在某个SSR座位上的多态性。

SSR标记完全符合作物品种鉴别的4个基本准则：环境的稳定性、品种间变异的可识别性、最小的品种内变异性和实验结果的可靠性。

但是，对于品种间没有位点差异的，误判为两个品种相同；不同平台之间不能直接比较，整合需要设立参照样品，甚至不同型号毛细管电泳仪之间的数据也需要进行位点的校准才能实现互通；毛细管电泳虽然可以实现多重，如果要增加通量和引物的数量，就会成倍增加工作量，大幅增加检测成本。

3.5 SNP标记技术

SNP标记是在基因组上单个核苷酸的变异形成的遗传标记。此法标记密度高，与功能基因的关联度高，更容易开发到与性状相关的SNP功能标记，遗传稳定性强，检测通量高，易实现自动化分析。SNP标记一般只有两种等位基因型，数据统计简单，且不依赖检测平台，容易实现不同来源数据的整合和标准化。

我国在农作物DNA鉴定指纹研究发展较快，特别是在主要农作物品种DNA分子检测技术标准化和应用方面。在GB/T3543.5-1995《农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定》第1号修改单中，增加6.2.4条即DNA分子检测方法：品种真实性验证或身份鉴定，允许采用SSR和SNP分子标记方法。

截至2014年6月底，现行有效的农作物分子检测标准有18项，涉及15类农作物。如NY/T 1432-2014、NY/T 2470-2013、NY/T 2595-2014、NY/T 2469-2013、NY/T 1433-2014，即玉米、小麦、大豆、陆地棉和水稻品种鉴定技术规程SSR标记法等。同时，新种子法第四十七条规定“：农业、林业主管部门可以采用国家规定的快速检测方法对生产经营的种子品种进行检测，检测结果可以作为行政处罚依据”，这为种子质量监督及时到位提供了法律依据，也更加速了SSR标记法的推广应用，在种子质量管理上发挥越来越重要的作用，为打击假冒伪劣种子，保护育种者、种子生产经营企业和农民的合法权益提供重要的技术保障。

1005-2690（2016）08-0033-02

：S339.36+1

：A

2016-07-21）

王灵敏(1986-），女，河北石家庄人，本科，高级农艺师，从事种子质量监督与种子管理工作。