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伤科接骨片对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响

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目的观察伤科接骨片对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响。方法取BALB/c小鼠30只，随机分为药物+细胞组：伤科接骨片及饲料喂养+MC3T3-E1+明胶海绵；细胞组：单纯饲料+ MC3T3-E1+明胶海绵；阴性对照组：单纯饲料+生理盐水+明胶海绵。每组10只。在小鼠右侧股部臀大肌下方制成肌袋，药物+细胞组和细胞组用无菌明胶海绵吸附MC3T3-E1细胞悬液、阴性对照组用无菌明胶海绵吸附生理盐水后植入肌袋内。术后3天，药物+细胞组将伤科接骨片（0.35g/片）用蒸馏水配制成浓度为20mg/mL的混悬液，按2.0mg/（g·d）剂量灌胃给药，细胞组和对照组均灌胃给予2.0mg/（g·d）的蒸馏水。分别于建模后第4、8周每组各处死小鼠5只，取材后分别作大体、切片HE染色光镜，以及扫描电镜下观察。结果 术后4周，药物+细胞组和细胞组肌袋内均可见新骨出现，术后8周两组均形成松质骨样结构的板层骨，药物+细胞组形成的板层骨结构较细胞组更为成熟，成骨细胞数量更多，胶原纤维分泌量也更多，并有更多的钙化结节形成。阴性对照组内未见有明显骨化现象。结论伤科接骨片可以促进MC3T3-E1细胞在动物体内的成骨作用。

小鼠；伤科接骨片；MC3T3-E1细胞；成骨能力

伤科接骨片是由海星、鸡骨、三七、血竭、红花等组成的纯中药制剂，主要功效活血化瘀，促进骨折愈合等。已有研究[1]从组织学和生物力学等方面证实，该药能明显改善血液循环，促进血肿机化，并促进骨痂钙化等作用。但到目前为止，该制剂对成骨细胞在体内的作用仍不甚明了。为此，本实验拟通过观察伤科接骨片干预小鼠体内MC3T3-E1细胞的成骨作用，探讨其促进骨折愈合的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄BALB/c小鼠30只（许可证号：SCXK（京）2012-0001，北京维通利华实验动物技术有限公司提供），雌雄各半，体质量为22～26g。饲养于浙江中医药大学实验动物中心普通级动物房（动物饲养合格证号为SCXK（浙）2013-0184），定时投放食水，做好标记，每周复称体质量，实验室温度为16-25℃，湿度为40%～80%。

1.2 主要材料 伤科接骨片（药物组成：海星、鸡骨、三七、血竭、红花等，大连美罗中药厂有限公司，0.35g/片，批号201410389）。MC3T3-E1细胞（中科院上海细胞库提供），取MC3T3-E1细胞株解冻复苏后培养，当细胞长满约90%后用0.25%胰酶消化制成1×105/L的细胞悬液。地塞米松（Sigma公司）、高糖DMEM（Biogen Idec公司）、胎牛血清（Biogen Idec公司）、抗坏血酸（Sigma公司）、0.25%胰酶（Biogen Idec公司）、β-磷酸甘油钠（Sigma公司）等。

1.3 主要仪器 超净工作台（Thermo，SW-CJ-2FD，美国）、低速离心机（Beckman，美国）、细胞培养箱（Forma，美国）、流式细胞仪（Moflo，Beckman Coulter）、倒置显微镜（Olympus，日本）、相差显微镜（Olympus）、照相机（Toshiba，日本）、荧光显微镜（Olympus）、数码相机（Olympus）、石蜡切片机（Leca，德国）、XL-30环境扫描电子显微镜（Philips，荷兰）、干燥仪（Abbott,LDM150D，美国）、HCP-2离子溅射仪（Hitachi，日本）等。

1.4 动物分组和模型构建 30只实验小鼠随机分为三组，每组10只：（1）药物+细胞组：伤科接骨片及饲料喂养+MC3T3-E1+明胶海绵；（2）细胞组：单纯饲料喂养+MC3T3-E1+明胶海绵；（3）阴性对照组：单纯饲料喂养+生理盐水+明胶海绵。三组均经腹腔内注射0.25mL浓度为6g/L的戊巴比妥钠麻醉，按文献方法[2]于每只小鼠右侧股部臀大肌下方作一1.0cm的皮肤切口，切开皮肤及皮下组织，暴露肌肉组织，肌间隙内以止血钳钝性分离制成肌袋，然后将0.5cm×2.0cm×2.0cm大小的无菌明胶海绵折叠后吸附2mL的1×105/L MC3T3-E1细胞悬液（药物+细胞组和细胞组），或者2mL生理盐水（阴性对照组）植入所制作的肌袋内。逐层缝合切口，常规肌肉注射庆大霉素（4万U/次，1天1次，3天）预防感染。术后将小鼠分笼饲养，每组均给予常规饲料喂养。3天后药物+细胞组将伤科接骨片（0.35g/片）用蒸馏水配制成浓度为20mg/mL的混悬液，按2.0mg/（g·d）的剂量灌胃给药，细胞组和对照组均灌胃2.0mg/（g·d）的蒸馏水。各组每日灌胃给药1次，共8周。

1.5 取材及观察 建模4、8周，各组随机取小鼠各5只麻醉后断颈处死，取肌袋内实验材料后大体观察。取部分组织双醛固定（2%多聚甲醛+2.5%戊二醛）12h，10%EDTA脱钙，常规组织学石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。剩余部分组织立即放入2%戊二醛中固定2h以上，去除固定剂，用PBS漂洗2次，每次10min，再用1%饿酸固定1h，PBS清洗3遍，乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥脱水，表面喷金后扫描电镜观察。

2 结果

2.1 大体观察 建模后4周各组所取材料可见明胶海绵均大部分被降解，药物+细胞组和细胞组均见板层骨生成，但前者周围肌肉内部的硬化现象更为明显。阴性对照组的肌袋内除残留部分明胶海绵外，未见明显成骨现象。8周后，各组肌袋中明胶海绵均被降解完全。药物+细胞组和细胞组所生成的板层骨组已更为成熟，并可见骨髓样组织存在于板层间的髓腔内，肌袋周围可见骨化的肌肉并与肌袋内骨相连。而阴性对照组未见明显骨化现象。

2.2 光镜观察 光镜下观察，建模后4周可见药物+细胞组较细胞组所形成新骨量多，但骨组织结构尚不成熟，板层骨厚度较薄，内部组织中见由多个软骨细胞组成的软骨岛，其中部分软骨细胞存在胞膜皱缩退化现象，软骨岛周围有矿化带，而在细胞组未见明显软骨岛形成。8周光镜下可见药物+细胞组形成更为成熟的板层骨，孔隙相连，骨胶原和钙沉积较多，属类松质骨样骨。新形成的骨外有骨膜包绕，光镜下可观察到骨膜下成骨，见图1（封二）。

2.3 电镜观察 高倍扫描电镜下观察8周取样标本，可见药物+细胞组形成的板层骨为类似松质骨样结构，有较多的孔隙，孔隙的孔壁上有较多的成骨细胞，纤维样胶原由成骨细胞所分泌，且在胶原之间聚集着较多的颗粒状矿物质。骨胶原与颗粒状的矿物质相互包绕形成结节样突出；细胞组形成更疏松、更欠成熟的类松质骨样结构，并且只有少量纤维样胶原和钙结节形成，见图2（封二）。

3 讨论

MC3T3-E1细胞是一种通过分离培养从胎鼠颅骨中所获取的前成骨细胞，具备向成骨细胞单向分化的特性，具有相应的成骨化能力，而且其细胞形态、表型和功能均与成骨细胞相似。成骨细胞虽为成熟细胞但不具备分裂增殖能力，而前成骨细胞具有强大的分裂增殖的能力，因此，MC3T3-E1细胞是研究成骨细胞的常用替代细胞系[3]，该细胞体外培养下能够分泌ALP，I型和Ⅲ型胶原，形成钙结节[4]，植入动物肌袋内后具有形成板层骨的能力，因此本实验选择MC3T3-E1细胞作为实验细胞，观察伤科接骨片的促成骨能力。

实验发现，大体、光镜和扫描电镜观察，药物+细胞组和细胞组两组虽然MC3T3-E1的成骨结构相似，但成骨能力前者要高于后者。前者实验组中所形成的类似于松质骨样的板层骨更为成熟，骨结构中有较多的成骨细胞以及多个孔隙相通，成骨细胞分泌较多的胶原和矿物质颗粒，两者相互缠绕形成结节突向孔隙内。骨折愈合是一个复杂的病理过程，成骨模式有成骨细胞直接成骨、软骨内成骨和骨膜下成骨。成骨细胞的再生是骨折愈合的基础，在充分的血液供应下，骨折局部间叶细胞分化为成骨细胞的数量增加，因此，成骨细胞所形成骨基质和基质钙化亦得到保证。姜琳等[5]观察到，小鼠骨折2周，伤科接骨片组小鼠骨痂中见到成熟活跃的成骨细胞。本实验中也观察到类似现象，药物+细胞组中成骨细胞数量远远多于对照组。由此可见，伤科接骨片可以促进动物骨痂中的成骨细胞增殖分化。

骨中的胶原纤维主要为I型胶原，占全部胶原的90%，是成骨细胞合成的特异性胶原，在骨组织中具有加大机械力量的作用。伤科接骨片中的动物类药（海星、鸡骨、土鳖虫）可以为骨胶原合成提供所必需的多种氨基酸，发挥其促进胶原合成的作用。魏玉玲等[6]观察到伤科接骨片药物组与对照组比较，I型胶原mRNA的表达量无论在骨折后2周或4周，前者均大于后者，说明伤科接骨片能促进骨折的骨化和塑型，增进骨折愈合的质和量。本实验中，也同样发现药物+细胞组中纤维性胶原生成量高于细胞组，显示伤科接骨片可通过激活成骨细胞的活性促进胶原合成，从而达到促进骨折愈合的目的。此外，伤科接骨片富含的钙质可成为软骨成骨和骨痂的改造塑形的钙质来源，也为本实验中药物+细胞组新生骨内含量较多的钙颗粒提供了来源依据。已有研究[7]证实，接骨片能缩短类骨质的矿化延迟时间，促进类骨质提前钙化，使骨痂提早成熟。

综上所述，伤科接骨片可以促进MC3T3-E1细胞在动物体内的成骨作用，有利于成骨细胞的增殖分化，胶原合成及基质钙化等，故对骨折愈合有明显的促进作用。

［1］宫丽，张继平.伤科接骨片促进骨折愈合研究进展［J］.中国中医药信息杂志，2006，13（5）：92-94.

［2］张一，孙立，简月奎，等.双基因活化纳米骨浆的体内成骨［J］.中国组织工程研究，2014，18（3）：329-334.

［3］Calvert JW，Chua WC，Gharibjanian NA，et al.Osteoblastic phenotype expression of MC3T3-E1 cells cultured on polymer surfaces［J］.Plast Reconstr Surg，2005，116（2）：567-576.

［4］Chen VJ，Smith LA，Ma PX.Bone regeneration on computerdesigned nano-fibrous scaffolds［J］.Biomaterials，2006，27 （21）：3973-3979.

［5］姜琳，魏玉玲，杨洪平，等.伤科接骨片促进实验性骨折愈合的超微结构观察［J］.中医正骨，2000，12（11）：3-4.

［6］魏玉玲，王炳南，粱克玉.伤科接骨片对I、II型胶原基因表达的影响［J］.中医正骨，1998，10（5）：3-5.

［7］黄长联，董海辉，周建光，等.跌打接骨片促进实验性骨折愈合的骨组织形态计量学研究［J］.中医药研究，2001，17 （4）：47-49.

（收稿：2015-12-14 修回：2016-01-12）

Effects of Shangke Jiegu Tablet onthe Role of MC3T3-E1 Cells in Osteogenesis PromotionIn Vivo

ZHANG Li1,GAO Jianli2,ZHANG Hua3,LI Zhaodong1. 1 Department of Clinical Laboratory,Traditional Chinese Medical and Western Medical Hospital,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310003),China;2 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;3 Deparptment of Orthopaedic Surgery,Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou(310009),China

ObjectiveTo investigate the effects of Shangke Jiegu Tablet on the the role of MC3T3-E1 cells in osteogenesis promotionin vivo.MethodsThirty healthy BALB/c mice were randomly divided into 3 groups（10 rats each）:drug+cell group,cell group,and negative control group.During the animal operation,the muscle pouch was made in the right thigh of the mouse,and the sterile gelatin sponge was used to absorb the MC3T3-E1 cell suspension or saline.Conventionaldiet was given after operation,and 3days later,the above groups were given treatment by gastrogavagerespectively as follows:Shangke Jiegutablets（0.35g/tablet）withdistilled water toa concentration of 20mg/mL suspension,and 2.0mg/（g·d）in drug+cell group;2.0mg/（g·d）of distilled water incellgroup and negative controlgroup.Every 5 mice were executed at 4 and 8 weeks after oral adiministration,and the specimens were harvested and observedwith HE staining and light microscope and scanning electron microscopy.ResultsFour weeks after operation,the new bone appeared in the drug+cell and cell groups;at 8 weeks,the cancellous bone with a lamellar structure was formed in both groups.In drug+cell group,more mature cancellous bone,collagen secreted by osteoblasts,and calcified nodules were formed compared withcell group.No new bone was observed in negative control group.ConclusionShangke Jiegu tablet is conducive to the osteogenesis induced by MC3T3-E1 cells in vivo.

Mice;Shangke Jiegu tablet;MC3T3-E1 cells;Osteogenesis

高等学校博士学科点专项科研基金（No.20110101120122）

1.浙江中医药大学附属中西医结合医院检验科（杭州310003）；2.浙江中医药大学（杭州 310053）；3.浙江大学医学院附属第二医院骨科（杭州 310009）

李召东，E-mail：dglihh@126.com