朱佳芳　于文心　马刚　林晓曦

葡萄酒色斑中GNAQ基因突变的研究进展

朱佳芳于文心马刚林晓曦

【提要】鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽（G uanine nucleotide binding protein q polypeptide，GNAQ）是GTP结合蛋白异源三聚体的组成部分，能够通过结合细胞表面受体介导下游信号通路。最近的研究发现，葡萄酒色斑（P ort-wine stains，PWS）中GNAQ p.Arg183点突变，可能介导细胞外信号调节激酶（E xtracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路。本文对GNAQ基因突变可能介导的下游信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、G蛋白信号调节因子5（regulator of G protein signaling 5，RGS5）、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和YAP等信号通路进行综述。

葡萄酒色斑鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽丝裂原活化蛋白激酶G蛋白信号调节因子5蛋白激酶C

葡萄酒色斑（Port-wine stains，PWS）是先天性毛细血管畸形，发病率约为0.3%。Sturge-Weber综合征是以三叉神经眼支支配区域、软脑膜和脉络膜毛细血管静脉畸形为主要特征的综合征，主要表现为V1/V2区PWS、青光眼、癫痫、休克及智力发育迟缓等[1]。Shirley等证实了PWS中存在体细胞突变，发现了GNAQ p.Arg183Gln点突变[2-3]，以及该位点其他突变类型[4-5]，和该突变分布的组织类型[6]。但该突变所参与的信号通路至少有部分与肿瘤中GNAQ常见的突变p.Gln209Leu存在差异[2]，可能是其导致血管壁不正常扩张而非恶性肿瘤的原因所在。

1　GNAQ基因及其蛋白质

1.1GNAQ基因

编码人鸟嘌呤核苷酸结合蛋白q多肽（GNAQ）的基因位于9q21.2，跨越310 993核苷酸序列，包含7个外显子区域，转录长度为6 539碱基对（Base pair，bp），开放读码框（Open reading frame，ORF）长度为1 080 bp[7]。

1.2GNAQ蛋白结构

G蛋白根据其α亚单位分成4个家族，包括Gi、Gs、G12/ 13和Gq。Gq家族包含4个成员：Gq、G11、G14和G15/16。其相应的α亚单位为Gαq、Gα11、Gα14、Gα15/16[8]。GNAQ编码Gαq蛋白由359个氨基酸组成，包含两个结构域，一个Ras样三磷酸鸟苷酶结合结构域（Ras-like GTPase binding domain）以及一个α螺旋结构域（αhelical domain）。这两个结构域之间形成一个口袋结构能够结合二磷酸鸟苷（G uanosine diphosphate，GDP）。在GTPase结构域中有3个活动结构域称之为开关（Switch），包括SwitchⅠ、SwitchⅡ、SwitchⅢ，该结构域氨基酸残基结合GTP后能发生构像改变[9]

1.3Gαq蛋白功能

G蛋白偶联受体（G protein coupled receptors，GPCRs)是由7个α螺旋组成的跨膜蛋白，是一类细胞表面的受体家族[10]。GPCRs主要通过与G蛋白结合激活下游信号通路。当细胞外配体与GPCRs相结合后，其构像发生改变，形成一个结合袋，与胞质内的G蛋白异源三聚体Gαβγ结合，GPCR能起到鸟嘌呤核苷酸交换因子（Guanine nucleotide exchange factor，GEF）的作用，催化α亚单位释放GDP并与胞质内高浓度的GTP结合，在活化状态下，Gα亚单位与G-βγ亚单位分离，switchⅠ～Ⅲ发生构像改变[11]。结合GTP的Gα亚单位或G-βγ亚单位，能通过活化二级信使，如腺苷酸环化酶（A denylyl cyclase）、磷脂酶C（P hospholipase C，PLC），激活下游信号通路[12]。G蛋白信号调节因子（G-protein signaling，RGS）家族能够加速GTPase的作用，使GTP水解为GDP，此时的Gαq转变为非活化状态，再次以G蛋白异源三聚体的形式存在于胞内，停止激活下游信号通路。

2　PWS中GNAQ基因突变

2.1GNAQ（c.548G＞A,p.Arg183Gln）点突变

Shirley等报道了Sturge-Weber综合征患者以及PWS患者中GNAQ 4号外显子单核苷酸突变（c.548G＞A,p. Arg183Gln）。该报道对Sturge-Weber综合征患者组织活检并进行全基因组测序，发现了GNAQ（c.548G＞A,p.Arg183Gln）点突变。该研究组进一步对Sturge-Weber综合征的患者以及无症状的PWS患者取样测序，发现Sturge-Weber综合征的患者GNAQ总突变率在88%（23/26），无症状PWS患者突变率在92%（12/13），标本中等位基因突变频率为1.0%～18.1%。但并未发现热点突变，如GNA11、GNAQ p.Gln209等的突变[2]。

2.2GNAQ（c.547C＞G,p.Arg183Gly）点突变

Frigerio等在证实原有突变位点的基础上，首次在PWS皮肤组织中发现1例新的GNAQ（c.547C＞G,p.Arg183Gly）点突变，组织中突变频率为4%[4]。

2.3组织分布

Tan等利用激光显微切割技术（L aser capturem icroscopy，LCM）从10例PWS皮肤病灶中分离出血管、表皮、毛囊和结缔组织，利用巢式PCR（Nesting PCR）技术分析了GNAQ（c. 548G→A,p.Arg183Gln）点突变在组织中的分布，证实了该突变60%（6/10）分布在血管，突变率为3.16%～12.37%。这6例中，20%（2/10）分布在结缔组织，突变率分别为22.17%和6.43%。另外4例血管内未发现突变，但其中2例结缔组织和（或）毛囊/腺体内发现GNAQ突变，突变频率为2.67%～6.62%[6]。Uchiyama等利用肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）以及数字微滴多聚酶链（Droplet digital PCR，ddPCR）反应技术，提升了组织中GNAQ突变的检测极限，达到0.1%（3个拷贝数），并首次在10%（4/40）的Sturge-Weber综合征患者血液白细胞和唾液中发现了GNAQ突变[13]。

2016年，Salato等利用ddPCR技术发现18例散发PWS患者组织内100%（18/18）存在GNAQ（c.548G→A,p. Arg183Gln）点突变，而Sturge-Weber综合征患者100%（4/4）皮肤组织及60%（3/5）脑组织中存在该突变。该突变可能成为鉴别PWS与其他脉管畸形的重要依据之一。

3　突变可能介导的相关信号通路

3.1MAPK信号通路

活化状态下的Gαq通过激活PLCβ，使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（Phophotidy linositol diphosphate PIP2）水解成肌醇三磷酸（Inositol triphosphate，IP3）和甘油二酯（Diacylglycerol，DAG）[14]。IP3和DAG进一步通过二级信使如钙离子和蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）传导信号通路。PKC能够通过磷酸化Raf/MEK1/2/ERK信号通路，从而激活MAPK信号通路[15]。Shirley等[2]发现，GNAQ p.Arg183Gln点突变能使ERK表达量显著增加，但不能使p38和c-Jun氨基端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）过表达，推测GNAQ p.Arg183Gln点突变是通过ERK途径过度激活MAPK信号通路。Shirazi检测到MAPK下游信号通路磷酸化核糖体蛋白S6（Phosphorylated ribosomal protein S6，RPS6），存在于Sturge-Weber综合征患者PWS组织的畸形血管壁内，推测RPS6可能是PWS中MAPK的下游潜在靶点之一[16]。

3.2RGS5信号通路

RGS能够调节Gα蛋白GTPase的作用，抑制下游信号通路。RGS5是RGS家族成员之一，主要在血管平滑肌细胞（V ascular smooth muscle cells，VSMC）以及周细胞（P ericytes）中表达，潜在的作用靶点为Gi和Gq。Cho等发现敲除Rsg5等位基因的小鼠主动脉扩张，血压明显降低，提示该RSG5可能是调节血管收缩的重要因子[17]。PWS组织内主要病理特征为毛细血管及微静脉扩张畸形，猜测GNAQ突变后，其GTPase结构域可能失去RGS5调控作用而最终导致微血管不正常扩张。

3.3PKC信号通路

PKC蛋白家族至少由7个密切相关的蛋白质组成，被划分为经典型（α，β，γ），新型（δ，ε，η，θ）以及非典型（ζ，λ/ι）等3种同源异构体（I soform）。Wu等[18]发现，enzastaurin能够选择性抑制经典型（β，γ）以及新型（δ，ε，θ）同源异构体，将GNAQ突变细胞系抑制在G1期，并增加细胞凋亡。该机制可能是通过减少ERK磷酸化和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）表达从而减少MAPK信号通路激活实现。Sotrastaurin为PKC更强的抑制剂，进一步证实了ERK在PKC信号通路中的作用[19]，同时，也发现其减少了核转录因子-kB（N uclear transcription factor-kB，NF-kB）信号通路的表达。因此，PKC/NF-kB可能是独立于MAPK的另一条信号通路[20]。

3.4YAP以及下游信号通路

Hippo信号通路参与器官大小的形成，该通路异常会导致恶性肿瘤的发生。Hippo信号通路中，MST1/2以及Lats1/2激酶能够使YAP磷酸化，使其在胞质中处于失活状态。YAP/ TAZ去磷酸化能够激活转录因子TEAD和SMAD家族，使细胞增生[21]。细胞转导了GNAQ基因突变后，使得YAP/TAZ去磷酸化并激活。Feng等[22]发现，突变的GNAQ蛋白是通过GEF Trio以及下游的GTPase Rho/Rac调节YAP信号通路。Rho/Rac能够聚合肌动蛋白并游离血管抑素结合蛋白（A ngiomotin），增加YAP进入核内的能力，从而导致核内转录水平增加。

4　展望

GNAQ中的GTP结合袋（Guanosine triphosphate binding pocket，GTP）结构域183位点精氨酸残基在所有人Gα亚单位中保守，是GTPase的关键位点。该位点精氨酸残基被谷氨酸残基所取代，可能会使下游信号通路异常激活[23]。GNAQ p. Arg183Gln点突变能使ERK表达量显著增加，但不使p38和JNK过表达[2]。最近研究发现PWS患者组织中ERK和JNK表达量增加，提示PWS中可能存在其他突变介导该信号通路的发生[4]。利用新的PNA-ddPCR技术，能够使GNAQ突变检测极限达到0.1%（3拷贝数）[13]。近来，通过二代测序已经在PWS组织中发现了RASA1、SMARCA4、EPHA3、MYB、PDGFR-β和PIK3CA等新的突变[5]，但是GNAQ基因突变仍是组织中最精准可靠的突变位点，随着检测技术的更新及普及，未来该突变可能成为鉴别PWS与其他脉管畸形的重要依据之一。

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GNAQ M utations in P ort-W ine S tains

ZHU Jiafang,YUWenxin,MA Gang,LIN Xiaoxi.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:LIN Xiaoxi(E-mail:linxiaoxi@126.com).

【Summary】G-alpha-q(GNAQ)is the alpha subunit of the heterotrimeric GTP-binding proteins that mediates the regulators of several downstream signaling through coupling cell surface receptors.Recently,lesionswithin port-wine stains are found harbormutations in GNAQ p.Arg183 and may at least associate with ERK(extracellular signal-regulated kinase) signaling pathways.In this paper,themutations of GNAQ within port-wine stains and themultiple activated signaling targets downstream ofmutant GNAQ,including MAPK,RGS5,PKC and YAP pathwayswere reviewed.

Port-wine stains;Guanine nucleotide binding protein q polypeptide;Mitogen-activated protein kinase; Regulator of G protein signaling 5;Protein kinase C

R732.2

B

1673－0364（2016）05－0322－03

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.05.014

国家自然科学基金面上项目（81272127）；上海市卫生系统重要疾病联合攻关重点项目（2013ZYJB0014）。

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

林晓曦（E-mail：linxiaoxi@126.com）。

（2016年3月9日；

2016年3月30日）