网络出版时间：2014-12-4 13:45网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.018.html

PLCE1调控p53诱导食管癌细胞凋亡的实验研究

李昀，张军航, 安军，何锦园，黄邵洪

(中山大学附属第三医院心胸外科，广东 广州510630)

中国图书分类号：R329.25；R345.61；R735.102.2；R977.3

摘要:目的探讨磷脂酶Cε1(PLCE1)基因抑制食管癌细胞凋亡的作用机制。方法选用人食管癌细胞株OE33和CP-C作为研究对象。采用qRT-PCR、Western blot法分别检测转染PLCE1 siRNA前、后食管癌细胞OE33和CP-C中PLCE1、p53 mRNA和蛋白水平的表达；甲基化特异性PCR重亚硫酸盐法检测p53启动子区甲基化状态；流式细胞仪检测细胞凋亡。结果食管癌细胞株OE33和CP-C均高表达PLCE1，抑制PLCE1表达后食管癌细胞CP-C中p53表达上调并促进p53去甲基化，细胞凋亡明显增加。结论PLCE1通过促进p53启动子区甲基化抑制p53 的表达，从而抑制食管癌细胞凋亡。

关键词：食管癌；磷脂酶Cε1；p53；细胞凋亡；小干扰RNA；表观遗传学

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.018

文章编号：

文献标志码：A1001-1978(2015)01-0082-05

收稿日期:2014-09-20,修回日期:2014-10-12

基金项目：中山大学“985工程”工程项目(No 82000-31101301)

作者简介：李昀(1981-)，男，博士，主治医师，研究方向：胸部肿瘤发病机制，E-mail: yunmao@163.com；

通讯作者黄邵洪(1976-)，男，博士，主治医师，研究方向：胸部肿瘤基础与临床，,E-mail: legendhuang@126.com

Abstract:AimTo investigate the role of phospholipase C epsilon 1 (PLCE1) in modulating the apoptotic mechanism in esophageal cancer (Eca) cells. MethodsEca cell lines, OE33 and CP-C cells were cultured to assess the expression of PLCE1. siRNA suppress expression of PLCE1. The expression of PLCE1 and p53 was evaluated by quantitative real time PCR and Western blot. Methylation analyses of p53 were performed by bisulfite conversion of genomic DNA. Apoptosis was assessed by flow cytometry. ResultsOE33 and CP-C cells expressed high levels of PLCE1. Knockdown of PLCE1 markedly increased the expression and hypomethylation of p53, and increased the frequency of apoptosis. ConclusionPLCE1 suppresses apoptosis of Eca cells via promoting p53 promoter methylation and inhibiting expression of p53.

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率居恶性肿瘤第5位，死亡率居第4位[1]，5年生存率低于15%[2]，但其发病机制尚不十分清楚，且目前的治疗效果不甚理想。

在正常生理状态下，细胞分化与凋亡维持在平衡状态。当细胞不能接受信号启动凋亡，处于无限生长状态就可能引起肿瘤的发生。如抑癌基因p53表达降低与多种肿瘤发生密切相关，包括食管癌。p53可引起细胞周期阻滞、凋亡及维持基因组稳定性从而抑制肿瘤[3]，但是p53在食管癌中失活的机制有待进一步阐明。

磷脂酶Cε1(phospholipase C epsilon 1，PLCE1)是近年发现的磷脂酶C家族的新成员，其定位的染色体是最近发现的食管鳞癌易感位点。PLCE1在细胞信号转导过程中起重要作用，调节细胞生长、增殖、分化，影响细胞骨架改变、细胞运动、细胞凋亡、肿瘤生长及发展等生物学行为。本研究拟通过检测PLCE1在食管癌细胞株OE33和CP-C中的表达，验证改变PLCE1表达对食管癌细胞功能的影响，初步阐明PLCE1通过p53途径在食管癌细胞中发挥作用的机制。

1材料与方法

1.1试剂PLCE1抗体(sc-28402)、p53抗体(sc-6243)、兔抗羊(sc-276)及羊抗兔二抗(sc-2004)、β-actin抗体(sc-130301)、PLCE1 siRNA(sc-44024)和对照siRNA(sc-37007)购自Santa Cruz Biotech。Annexin V试剂盒购自Sigma。DNA纯化盒购自Promega。甲基化检测盒购自Clontech。转染试剂lipofectamine2000、质粒抽提试剂盒、qRT-PCR和Western blot所用试剂均购自Invitrogen。PLCE1过表达载体(pcDNA3.1-PLCE1 )由中山大学肿瘤医院刘晓萍博士惠赠。

1.2细胞株、培养及转染食管癌细胞株OE33、CP-C及正常细胞株HEK293均购于中科院上海细胞库，用含10%胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 kU·L-1青霉素和0.1%链霉素的DMEM细胞培养液，在二氧化碳培养箱内(37℃、5%CO2、饱和湿度)连续培养并传代。培养液每3 d换液1次。当细胞长至瓶底80%时进行处理。细胞转染，根据转染试剂说明书进行，分别将siRNA及对照无关系列或PLCE1过表达载体、对照载体转染至食管癌细胞中，并设空白对照；转染48 h后提取总RNA或进行细胞凋亡检测，转染72 h后提取细胞总蛋白。

1.3实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)TRIzol法提取细胞总RNA并定量；按试剂盒说明进行逆转录合成cDNA。应用实时荧光定量RT-PCR检测，β-actin作为内参。PCR引物：p53：上游引物5′-GGAAATCTCACCCCATCCCA-3′，下游引物 5′-CAGTAAGCCAAGATCACGCC-3′；PLCE1：上游引物5′-GAGCTGCAATCGAAGTCTGG-3′， 下游引物 5′-AAGGCCTTCTGTGAGTCCTC-3′； β-actin(上游引物5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′， 下游引物 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′)。反应体系为20 μL，反应条件为95℃ 3 min预变性，95℃ 10 s，55℃ 30 s，39个循环，并在每个循环延伸末端点收集荧光信号，绘制扩增曲线，基因的表达量用2-ΔΔCt表示。

1.4Western blot预冷PBS洗涤细胞3次，加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min收集蛋白。将抽提蛋白用BCA法定量后，取50 μg于100 V泳道进行SDS-PAGE；电泳结束后，以90 V、90 min将蛋白转移至PVDF膜； 5%TBS牛奶室温封闭1 h，孵育一抗羊抗p53(1 ∶1 000)、兔抗PLCE1 (1 ∶500)4 ℃过夜，二抗(兔抗羊1 ∶5 000、羊抗兔1 ∶2 000)室温孵育1 h。每次抗体孵育后用TBST洗膜15 min，共3次。ECL试剂盒进行发光反应，压片、显影、定影，观察蛋白印迹并进行图像分析。

1.5细胞凋亡检测根据试剂盒进行操作，收集CP-C细胞先用Annexin V染色，再用碘化丙啶 (propidium iodide，PI，5 mg·L-1，15 min)染色。流式细胞仪检测细胞凋亡率，PI+细胞首先被检出，Annexin V+细胞频数在剩余细胞中确定。

2结果

2.1PLCE1在食管癌细胞中高表达本研究检测了食管癌细胞株OE33和CP-C细胞中PLCE1的表达。结果发现，OE33和CP-C细胞中PLCE1的mRNA和蛋白表达水平明显高于正常细胞HEK293，差异有统计学意义(P<0.01)(Fig 1)。

2.2抑制PLCE1促进食管癌细胞凋亡将PLCE1 siRNA转染至食管癌CP-C细胞中，抑制PLCE1的表达，检测细胞凋亡情况。结果表明，PLCE1 siRNA组细胞凋亡率最高，空白对照组(mock)与转染无关系列组(scramble)差异无显著性，PLCE1 siRNA与其它两组比较差异有统计学意义(P<0.01)(Fig 2)。

2.3抑制食管癌细胞中PLCE1表达可促进p53表达进一步采用qRT-PCR与Western blot检测PLCE1对食管癌CP-C细胞中p53表达的影响。结果发现，抑制CP-C细胞中PLCE1的表达后，p53表达上调。而在HEK293细胞过表达PLCE1后，p53表达下调(Fig 3)。

2.4PLCE1调节p53启动子甲基化甲基化特异性PCR结果提示HEK293细胞中甲基化状态的p53 小于20%，而CP-C细胞中，甲基化状态的p53 大于75%。干扰CP-C细胞中PLCE1表达后，p53启动子甲基化状态明显下调，而HEK293细胞过表达PLCE1后，p53启动子高甲基化(Fig 4)。

3讨论

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发生发展的分子机制多样。研究表明，基因突变、等位基因高频率杂合性缺失(LOH)、抑癌基因失活等均可促进食管癌的发生发展。如DNA聚合酶β(DNA polymerase β，DNA polβ)启动子发生突变，在食管癌细胞中表达增加[4]。抑癌基因p53所在染色体17p13区域存在LOH，导致表达失活，食管癌发生[5]。

Fig 1　Eca cells express high levels of PLCE1( n=26)

A: The bars indicate the relative mRNA levels of PLCE1 of OE33 and CP-C cells; B1-B2: The expression of PLCE1 protein was detected by Western blot,**P<0.01vsHEK293 cell.

Fig 2　Suppression of PLCE1 induces apoptosis in CP-C cells( n=26)

A: The dot plots indicate the frequency of dead CP-C cells (PI+) and apoptotic cells (Annexin V+); B-C: The bars indicate the summarized data of dead cells (B) and apoptotic cells (C),**P<0.01vsmock.

最近两项大样本全基因组关联研究(GWAS)发现了新的食管癌易感基因位点rs2274223，定位于染色体10q23的PLCE1基因[6-7]。PLCE1是近年发现的磷脂酶C家族的新成员，在细胞信号转导过程中起重要作用，调节细胞生长、增殖、分化，影响细胞骨架改变、细胞运动、细胞凋亡、肿瘤生长及发展等生物学行为[8-9]。目前有关食管癌中PLCE1表达水平的报道结果不尽一致，Chen 等[10]报道哈萨克族食管癌患者中PLCE1表达升高，其表达水平与肿瘤分期正相关。Hu等[11]则报道食管癌组织中PLCE1 mRNA表达水平下降，免疫染色分析提示基因型rs2274223 GG者 PLCE1染色分数低于AG型。而我们的研究发现PLCE1在食管癌细胞OE33和CP-C中均高表达，与chen的研究结果一致。分析出现这种情况的可能原因有：(1)样本数有差异；(2)种族差异；(3)环境因素。

表观遗传学调控是当今生命科学关注的前沿，在基因调控中起重要作用，其涉及的机制主要包括DNA甲基化、miRNA、组蛋白修饰及染色质重塑等。DNA甲基化是指DNA在甲基转移酶(DNA methyltransferase，DMT) 的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5′-CpG-3′的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。在真核生物中发现了3类DNA甲基转移酶(Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3a、Dnmt3b)。Dnmt1是一种维持性甲基化酶；Dnmt2可与DNA上特异位点结合；Dnmt3a和Dnmt3b是重新甲基化酶，它们使去甲基化的CpG位点重新甲基化，即参与DNA的从头甲基化。众多研究发现，在肿瘤发生发展的过程中，DNA甲基化能关闭某些抑癌基因的活性，去甲基化则诱导了癌基因的重新活化和表达[12]。本研究发现，CP-C细胞中甲基化状态的p53 大于75%，而抑制CP-C细胞中PLCE1的表达后，p53表达上调，p53启动子甲基化状态明显下调，提示抑癌基因p53启动子高甲基化在食管癌的发生发展中发挥重要作用。

细胞凋亡下调是肿瘤发生的重要原因之一，众多因子参与细胞凋亡的调控，如TNF-α促进细胞凋亡[13]，GS-459679抑制细胞凋亡[14]，SCO2 (细胞色素C氧化酶2合成物)可诱导p53表达从而促进细胞凋亡[15]。大量研究证实[16]，p53与细胞凋亡密切相关，p53能通过高尔基复合体转运Fas短暂促进血管平滑肌细胞表面Fas表达并促进Fas-FADD的结合诱导凋亡。肿瘤细胞过表达p53能诱导细胞凋亡，而特异性抑制剂分别抑制caspase-8及caspase-9后均能抑制这种p53依赖的凋亡，表明p53对死亡受体通路和线粒体通路均有影响[17]。通过本研究发现，抑制食管癌细胞中PLCE1的表达可促进p53的表达，进而促进食管癌CP-C细胞凋亡。

综上所述，我们推测， PLCE1通过促进p53启动子区甲基化抑制p53 的表达，从而抑制食管癌细胞凋亡。PLCE1可能成为食管癌治疗的新靶点。

Fig 3　Inhibition of PLCE1 upregulates expression of p53 in Eca cells( n=26)

A: PLCE1 inhibited expression of p53 mRNA; B1-B2: The levels of p53 protein was detected by Western blot. C1-C2: The Western blot showed the expression of PLCE1 in HEK293 cells. D1-D2: The PLCE1 gene knockdown results. Mock: Untreated group; siRNA: Treated with PLCE1 siRNA. scramble: Treated with control siRNA. HEK293 cells were treated with mock (HEK293a), or pPLCE1 (PLCE1 overexpression plasmid) (HEK293b), or control plasmid (HEK293c).**P<0.01vsmock.

Fig 4PLCE1 induces p53 promoter methylation(n=26)

HEK：HEK293；PLCE1-d: PLCE1 siRNA；csiRNA: Scramble；PLCE1 O-ex: PLCE1 plasmid；M: Methylated primer；U: Un-methylated primer.**P<0.01vsHEK cells

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PLCE1 modulates p53 expression and apoptosis in esophageal cancer cells

LI Yun, ZHANG Jun-hang, AN Jun, HE Jin-yuan, HUANG Shao-hong

(DeptofCardiothoracicSurgery,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China)

Key words: esophageal cancer; phospholipase cepsilon 1; p53; apoptosis; small interfering RNA; epigenomics