李　月，刘　戈，胡　佳

(1.中国医科大学附属第一医院，辽宁 沈阳 110001；2.上海现代制药股份有限公司，上海 201802；3.锦州市食品药品检验所，辽宁 锦州 121000)

超声波法提取蓝莓叶总黄酮的工艺优化

李月1，刘戈2，胡佳3

(1.中国医科大学附属第一医院，辽宁 沈阳 110001；2.上海现代制药股份有限公司，上海 201802；3.锦州市食品药品检验所，辽宁 锦州 121000)

摘要：以总黄酮提取率为考核指标，采用单因素实验与正交实验优化了超声波法提取蓝莓叶总黄酮的工艺条件，确定了最佳工艺条件为：提取溶剂为70%乙醇、固液比1∶35(g∶mL)、超声波功率210 W、提取时间40 min，在此条件下，总黄酮平均提取率为8.0%，工艺稳定性良好。与常规提取方法相比，超声波法提取蓝莓叶总黄酮具有省时、经济、环保等优势。

关键词：蓝莓叶；总黄酮；超声波法；提取工艺

蓝莓又称越橘、蓝浆果，属杜鹃花科越橘属植物。原产地为北美洲，我国主要分布在东北三省。蓝莓果是营养丰富的水果和食用原料，同时蓝莓叶也有很高的药用价值。蓝莓叶中含有较丰富的黄酮类成分，具有广泛的生物活性[1]。现代药理研究表明，蓝莓叶总黄酮具有抗氧化、抑制丙肝病毒复制、降低血糖等作用[1-3]。近年来，超声波提取技术在中药有效成分提取方面被广泛应用。超声波提取过程无须加热，减少了目标成分的化学结构改变。由于具有效率高、能耗低、污染少等特点[4]，超声波提取技术更适合产业化生产。作者采用单因素实验和正交实验的方法对超声波法提取蓝莓叶总黄酮的工艺进行优化，拟为后续中期实验及规模化生产提供参考。

1实验

1.1　材料、试剂与仪器

蓝莓叶，2014年9月下旬采收于沈阳时圣蓝莓产业园。将蓝莓叶置于干燥箱内50 ℃烘干至恒质量，用手提式粉碎机粉碎40 s，过60目筛，备用。

芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇等均为分析纯。

KH-400KDE型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；LD-200型手提式中药粉碎机，长沙常宏制药机械设备厂；UV-1100型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；RE-2000A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.2　方法

1.2.1蓝莓叶总黄酮的超声波法提取

称取干燥的蓝莓叶粉末2.0 g，置于锥形瓶中，按一定的固液比加入一定体积分数的乙醇溶液，浸泡20 min，将锥形瓶置于超声波提取仪内，用一定功率的超声波提取一定时间，将提取液4 000 r·min-1离心处理20 min，抽滤得上清液，用旋转蒸发仪减压回收溶剂，浓缩，用石油醚萃取浓缩液，除去叶绿素，得到蓝莓叶总黄酮样品溶液。

1)单因素实验

分别改变乙醇溶液的体积分数(40%～80%)、固液比(1∶15～1∶40，g∶mL，下同)、超声波功率(90～240 W)和提取时间(10～50 min)进行单因素多水平实验，考察以上因素对蓝莓叶总黄酮提取率的影响。

2)正交实验

根据单因素实验结果，以乙醇体积分数(A)、固液比(B)、超声波功率(C)、提取时间(D)为考察因素，以蓝莓叶总黄酮的提取率为考核指标，进行L9(34)正交实验以优化超声波法提取蓝莓叶总黄酮的工艺条件。正交实验的因素与水平见表1。

1.2.2蓝莓叶总黄酮提取率的测定

将超声波提取的样品溶液稀释、定容，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色体系发生显色反应，用分光光度法在500 nm波长处测定吸光度。以芦丁为对照品绘制标准曲线，拟合线性方程为：A=9.836c+0.0017(R=0.9994)，线性范围为5.6～56.0μg·mL-1。根据线性方程计算定容液中蓝莓叶总黄酮的浓度，按下式计算蓝莓叶总黄酮的提取率(F)：

表1　正交实验的因素与水平Tab.1　Factors and levels of orthogonal experiment

式中:c为定容液中总黄酮浓度，μg·mL-1；V为定容液的体积，mL；D为稀释倍数；m为蓝莓叶质量，g。

1.2.3超声波提取法与常规提取方法的对比

称取4份干燥蓝莓叶粉末各2.0 g,分别按照下列4种方法提取，比较蓝莓叶总黄酮的提取率。

煎煮法：用沸水提取、固液比1∶50、每次提取40 min、提取3次。

乙醇回流法：以70%乙醇溶液为溶剂、固液比1∶40、70 ℃回流提取2 h。

索氏提取法：以70%乙醇溶液为溶剂、固液比1∶50、索氏提取3 h。

超声波提取法：采用正交实验所确定的工艺条件。

2结果与讨论

2.1　单因素实验

2.1.1乙醇体积分数对超声波法提取蓝莓叶总黄酮的影响

室温下，在固液比为1∶20、超声波功率为120 W、提取时间为20 min的条件下，考察乙醇体积分数对蓝莓叶总黄酮提取率的影响，结果见表2。

由表2可知，蓝莓叶总黄酮提取率随乙醇体积分数的增大而先升高后降低。这是因为，在一定范围内提高乙醇体积分数，能改善其对蓝莓叶的浸润、渗透，增大黄酮类成分的溶出度。若乙醇体积分数过高，部分脂溶性大的杂质成分也被提取出来，黄酮类成分的提取率反而降低。此外，乙醇体积分数过高，出膏率也相应增多，为后期总黄酮的提纯工作增加了难度。因此，选择60%、70%和80%作为正交实验中乙醇体积分数的3个水平。

表2　乙醇体积分数对超声波法提取蓝莓叶总黄酮提取率的影响/%Tab.2　The effect of ethanol volume fraction on　extraction rate of total flavonoids from blueberry leaves　by ultrasonic method/%

2.1.2固液比对超声波法提取蓝莓叶总黄酮的影响

其它条件同2.1.1，乙醇体积分数为50%,考察固液比对蓝莓叶总黄酮提取率的影响，结果见表3。

表3　固液比对超声波法提取蓝莓叶总黄酮提取率的影响Tab.3　The effect of solid-liquid ratio on extraction rate of total flavonoids from blueberry leaves by ultrasonic method

由表3可知，当固液比不超过1∶35时，蓝莓叶总黄酮的提取率随溶剂用量的增大而提高。这是因为，根据Fick扩散定律，当溶剂用量增大时，超声提取体系的体积增大，体系中总黄酮的浓度下降，其与固液边界层的总黄酮浓度差加大，促使更多的黄酮类成分从物料中扩散到溶剂中，提取率升高。当溶剂量过大时，在超声波功率一定的情况下，超声波传递给单位体积溶剂的能量减少，提取率下降。因此，选择1∶25、1∶30和1∶35作为正交实验中固液比的3个水平。

2.1.3超声波功率对超声波法提取蓝莓叶总黄酮的影响

其它条件同2.1.1，乙醇体积分数为50%,考察超声波功率对蓝莓叶总黄酮提取率的影响，结果见表4。

表4　超声波功率对超声波法提取蓝莓叶总黄酮提取率的影响Tab.4　The effect of ultrasonic power on extraction rate of total flavonoids from blueberry leaves by ultrasonic method

由表4可知，当超声波功率低于180 W时，蓝莓叶总黄酮提取率随超声波功率的增大而提高。这是因为，超声波功率越大，超声波辐射压强产生的空化作用、扰动效应、高加速度、击碎和搅拌作用等多级效应就越强烈，物质分子运动的频率和速度就越快，溶剂穿透力越强，从而加速目标成分进入溶剂，提高了提取率[4]。当超声波功率超过一定限度时，由于超声波能量过大，造成物料内部组织结构坍塌，超声波的空化等效应下降[5]，提取率下降。因此，选择150 W、180 W和210 W作为正交实验中超声波功率的3个水平。

2.1.4提取时间对超声波法提取蓝莓叶总黄酮的影响

其它条件同2.1.1，乙醇体积分数为50%,考察提取时间对蓝莓叶总黄酮提取率的影响，结果见表5。

表5　提取时间对超声波法提取蓝莓叶总黄酮提取率的影响Tab.5　The effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids from blueberry leaves by ultrasonic method

由表5可知，提取时间在40 min内，提取率随提取时间的延长而提高；超过40 min以后，提取率有所下降。这可能是因为，超声波提取一段时间后，物料中的目标成分已几乎被提取完全，继续延长提取时间，超声波的热效应会使目标成分加速分解，提取率下降。权衡提取率与能耗等因素，选择20 min、30 min和40 min作为正交实验中提取时间的3个水平。

2.2　正交实验

正交实验的结果与分析见表6、方差分析见表7。

表6　正交实验结果与分析Tab.6　Results and analysis of orthogonal experiment

表7　方差分析结果Tab.7　The results of variance analysis

注：F0.05(2，2)=19.00。

由表6、表7可知，4个因素对蓝莓叶总黄酮提取率的影响大小顺序为:提取时间>超声波功率>乙醇体积分数>固液比，4个因素对总黄酮提取率的影响均无显著性差异。优化的提取工艺条件为A2B3C3D3，即乙醇体积分数为70%、固液比为1∶35、超声波功率为210 W、提取时间为40 min。按优化工艺条件进行6次平行实验，得到蓝莓叶总黄酮的平均提取率为8.0%，RSD为1.3%。说明所确定的超声波法提取工艺条件的稳定性良好。

2.3　超声波提取法与常规提取法的比较(表8)

表8　超声波提取法与常规提取法的比较Tab.8　Comparison of ultrasonic extraction method and conventional extraction method

由表8可知，超声波提取法与3种常规提取方法相比，蓝莓叶总黄酮的提取率较高，乙醇用量较少，而且大幅缩短了提取时间。因此，超声波法提取蓝莓叶总黄酮具有提取效率高、成本较低、溶剂污染少的特点[6]。

3结论

以总黄酮提取率为考核指标，采用单因素实验与正交实验优化了超声波法提取蓝莓叶总黄酮的工艺条件，确定最佳工艺条件为：提取溶剂为70%乙醇、固液比1∶35(g∶mL)、超声波功率210 W、提取时间40 min，在此条件下，总黄酮平均提取率为8.0%，工艺稳定性良好。与常规提取方法相比，超声波法提取蓝莓叶总黄酮具有省时、经济、环保等优势。

参考文献：

[1]李颖畅，孟宪军.蓝莓叶黄酮提取物抗氧化活性的研究[J].营养学报,2008,30(4):427-429.

[2]TAKESHITA M,ISHIDA Y I,AKAMATSU E,et al.Proanthocyanidin from blueberry leaves suppresses expression of subgenomic hepatitis C virus RNA[J].Journal of Biological Chemistry,2009,284(32):21165-21176.

[3]WANG L,ZHANG X T,ZHANG H Y.Effect ofVacciniumbracteatumthunb. leaves extract on blood glucose and plasma lipid levels in streptozotocin-induced diabetic mice[J].Journal of Ethnopharmacology,2010,130(3):465-469.

[4]姜涛，车环宇，刘畅.超声波法提取鱼腥草中总黄酮工艺研究[J].黑龙江医药，2010,23(4):557-559.

[5]王辰，高玲.超声波辅助提取葛根黄酮的工艺研究[J].长江大学学报(自然科学版)，2009,6(4):61-64.

[6]祝波，王亚红.正交优化超声波法提取瓦松总黄酮工艺的研究[J].中成药，2012，34(12):2426-2428.

Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Blueberry

Leaves by Ultrasonic Method

LI Yue1,LIU Ge2,HU Jia3

(1.TheFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China;

2.ShanghaiShyndecPharmaceuticalCo.,Ltd.,Shanghai201802,China;

3.JinzhouInstituteforFoodandDrugControl,Jinzhou121000,China)

Abstract：Using the yield of total flavonoids as evaluation index,the extraction process of total flavonoids from blueberry leaves by ultrasonic method was optimized by single factor experiment and orthogonal experiment.The optimum conditions were determined as follows:70% ethanol as extraction solvent,solid-liquid ratio of 1∶35(g∶mL),ultrasonic power of 210 W,extraction time of 40 min.Under above conditions,the average extraction rate of total flavonoids was 8.0%.This process has good stability.Compared with the conventional extraction method,ultrasonic extraction method has advantages of time saving,low cost and environmental protection.

Keywords：blueberry leaves;total flavonoids;ultrasonic method;extraction process

中图分类号：TQ 461

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2015)05-0048-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.05.012

收稿日期：2015-01-19

作者简介：李月(1980-)，女，辽宁沈阳人，硕士，主管药师，从事医院药学工作，E-mail:liyue1213@126.com。