张烨华 ，王立民 ，王聪慧 ，赵兴旺 ，丁新平 ，周平

（1石河子大学动物科技学院，石河子 832003；2新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室/新疆农垦科学院基因工程实验室，石河子832000；3石河子市石总场畜牧兽医服务中心，石河子，832000;4新疆西部牧业股份有限公司紫泥泉种羊场,石河子 832000）

微卫星（Microsatellites），也称为简单重复序列（Simple sequence repeats，SSRs）或短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STRs），其作为一种分子标记现已被广泛的应用于遗传学、亲缘关系、种群以及其他方面的研究。微卫星首先由Miesfeld等[1]于1981年在人类基因文库中发现，随后这种简单重复序列被Tautz等[2]证实广泛存在于真核生物中。与其他分子标记技术相比较，微卫星标记拥有明显优点[3]，如符合孟德尔遗传规律、共显性遗传、遗传性稳定、多态性丰富等。国内外的研究进展表明，微卫星标记现已被广泛地应用于多物种多层次的检测及分析，如蚌类、鱼类；肉品质分析、植物生态学和进化、绵羊群体多态性、牛亲子鉴定、家兔品种的遗传变异等[4-9]。

新疆是我国绵羊品种最多、遗传品质最复杂的省区，在长期生产实践中育成了许多具有特色的地方品种[9]。藏羊[10]是中国绵羊三大系之一，具有耐寒、耐粗放饲养、抗病力强等优良种质特性，主要分布在青藏高原及其毗邻的川、滇、甘等高寒地区，是具有青藏高原特色的品种资源。目前，有关藏羊遗传多样性方面的研究文献较少，杨燕等[11]对部分藏系绵羊研究，认为藏系绵羊各群体间亲缘关系及系统进化有待进一步研究。徐琳娜等[10]在藏系绵羊遗传多样性的研究进展中表明，有关藏系绵羊遗传特性的系统研究很少，需要进一步了解。李祥龙等[12]利用微卫星技术研究我国蒙古羊、乌珠穆沁羊、哈萨克羊、阿勒泰羊、滩羊和藏绵羊6个地方绵羊品种的研究。

本研究以新疆的地方绵羊品种（策勒黑羊、多浪羊、巴音布鲁克羊、巴什拜羊及阿勒泰羊）和藏羊为研究对象，探讨各品种绵羊的遗传多样性，旨在为品种资源保护、遗传育种工作提供参考依据；其次，研究藏羊与新疆品种之间的遗传多样性和系统发生树对于品种的起源进化研究、种质资源保护以及科学开发利用均具有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验样本包括6个绵羊群体，均来自新疆南疆地区，共计263只，每个群体随机采集约45只，均采用颈静脉采血，所采血样均为5 mL/只，EDTA抗凝，-20℃保存，用于DNA提取。各群体的样本数量见表1。

表1 6个绵羊品种信息Tab.1 Information of 6 sheep breeds

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及引物合成

1）DNA的提取：用天根的血液基因组DNA提取试剂盒提取;

2）根据相关文献[13]及 Genbank提供的信息先择8个座位的引物，交由生工生物工程（上海）有限公司采用HAP方法合成。引物信息见表2。

3）PCR扩增反应：95℃预变性4 min；94℃变性 30 s，53-62.8℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共33-40个循环；72℃充分延伸10 min。4℃保存。产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

表2 8对微卫星引物的详细信息Tab.2 Detailed information of 8 pairs of SSRs primers

1.2.2 数据分析

微卫星等位基因数据分析软件为Quantity One 4.6.2，用其分析所分离的微卫星片段大小；采用Excel Microsatellite Toolkit计算等位基因频率和等位基因大小范围；计算多态信息含量（Polymorphic information content，PIC）、群体杂合度（Heterozygosity，He）和有效等位基因数（Effective number of alleles，Ne）；采用Mega5.2分析软件构建其系统进化树。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA琼脂糖检测结果

将提取的部分基因组DNA采用2%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰（图1），说明提取的 DNA在浓度、纯度和质量上均较好。

图1 藏羊基因组DNA部分琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Part Agarose Gel Electrophoresis results of Tibetan sheep genomic DNA

2.2 PCR扩增产物非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

PCR产物用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用快速银染法显色。图2、图3分别为微卫星座位CMC133和AE129扩增产物的部分电泳图谱，显示CMC133和AE129微卫星座位在不同个体扩增产物的电泳结果。由图2、图3可知，同一微卫星座位对不同个体扩增产物不同，说明存在多态性。

图2 策勒黑羊在微卫星位点CMC133的部分扩增结果Fig.2 A portion of PCR results of CMC133 in Cele sheep

图3 多浪羊在微卫星位点AE129的部分扩增结果Fig.3 A portion of PCR results of AE129 in Duolang sheep

2.3 等位基因变异分析

通过对6个绵羊群体263只个体8个微卫星座位的PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，共发现130个等位基因。各微卫星座位等位基因的分布（表3）显示，在座位OarFCB304上发现的等位基因数较多，为20个，在座位MCM133上发现的等位基因数较少，为10个。等位基因的变异范围为2-38 bp，以座位OarFCB304上的变异范围最大。

表3 不同微卫星座位的等位基因Tab.3 Alleles of different microsatellite loci

2.4 遗传多样性分析

表4显示了6个绵羊品种中8个微卫星座位的平均PIC、He以及Ne，其中藏羊在PIC与He中最高，分别为0.8715和0.8922，在巴音布鲁克中最低分别为0.8350和0.8629；Ne在巴什拜羊群体中最高为9.8722，其次是藏羊群体为9.5361，最低的是巴音布鲁克群体为7.6882。由表4可见，6个绵羊品种中藏羊和巴什拜羊的遗传多样性较丰富，巴音布鲁克羊遗传多样性相对较低。

表4 6个绵羊群体中8个微卫星座位的PIC、He和NeTab.4 PIC，He，Ne of 8 microsatalfite locus in 6 sheep groups

2.5 遗传距离及进化树的构建

由图4可知，策勒黑羊与巴什拜羊聚为一类，巴音布鲁克羊与藏羊先聚为一类，然后与阿勒泰羊聚在一起。由表5可知，藏羊和策勒黑遗传距离最远为0.79，巴什拜羊与多浪遗传距离最近为0.26。

图4 6个绵羊群体NJ方法聚类Fig.4 The dendrogram of Neighbor-joining(NJ)method in 6 sheep groups

表5 6个绵羊群体间的遗传距离Tab.5 Genetic distances between breeds of six sheep

3 讨论

（1）本试验所选的绵羊8个微卫星座位，分别位于8条不同的染色体上，可最大限度地提供遗传信息。8个微卫星座位共检测到130个等位基因，平均等位基因大小为16.25 bp，其中最高的Ne是OarFCB304，为 20个，而 OarFCB48、BMS1004和SRCRSP9最低，为16个。因为一般选择Ne在5-19个为宜，这是因为Ne太少，不能提供足够的信息量，所以本研究选取8个微卫星位点。

（2）PIC能够反映微卫星片段多态性。Botstein等[14]]最早提出采用PIC衡量基因变异程度：当PIC＞0.5时，该位点为高度多态位点；0.25＜PIC＜0.5时为中度多态性位点；PIC＜0.25时为低度多态位点。在检测的8个微卫星座位中，巴音布鲁克的PIC最低，为0.8356。5个群体的PIC均大于0.5，表明这些群体均呈高度多态，适宜用于绵羊品种间遗传多样性分析，同时也表明本研究群体提供的遗传信息较高，具有较大的利用潜力。8个微卫星座位使6个品种绵羊之间存在差异，如巴什拜羊的多态信息含量0.8664，而策勒黑羊为0.8618，这种差异可能是绵羊品种在长期的自然和人工选择过程造成的。

（3）He反映各群体在多个位点上的遗传变异，被认为是度量群体遗传变异的1个最适参数就相同的分子标记而言，He的高低反映了群体的遗传一致性程度。He越低，表明该群体的遗传一致性越高，而群体的遗传变异越少，群体遗传多样性越低[15]，反之，则多样性越高。本实验用8个微卫星标记对6个肉用绵羊品种进行了遗传多样性分析，得出6个绵羊品种He 0.8629-0.8922，高于贾斌等[16]在新疆8个绵羊品种遗传多样性和系统发生关系的微卫星分析研究结果（He为0.5306-0.6224），也高于汤存伟[17]在新疆13个绵羊品种遗传多样性的微卫星分析研究结果（其He 0.6754-0.7530），这说明其原因一方面与选择的微卫星位点有关，另一方面说明所选的6个绵羊品种具有丰富的遗传变异。

（4）群体聚类分析能直观反映亲缘的远近，策勒黑羊与巴什拜羊聚为一类，这与闰景娟等[19]研究结果一致。本研究结果将巴音布鲁克羊与藏羊先聚为一类，然后与阿勒泰羊聚在一起，这与杨燕等[11]的研究结果一致。而新疆当地人民将多浪羊把当地的土种羊，在本品种选育基础上，从塔什库尔干引入的半粗毛羊，经过长期繁育而成。符合地理分布。

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