锌对缺血后适应预防糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

路航余欣赵昕

(吉林大学第一医院心血管病诊疗中心,吉林长春130021)

摘要〔〕目的探讨锌对离体糖尿病(DM)大鼠缺血后适应预防心肌缺血再灌注损伤作用的影响。方法高脂饮食联合链脲佐菌素(STZ)诱导建成2型DM(T2DM)大鼠模型，将40只雄性Wistar大鼠随机平均分为正常大鼠缺血再灌注组(A 组:N+I/R)，正常大鼠缺血后适应组(B组)，DM大鼠后适应组(C组)，锌干预DM大鼠后适应组(D组)。四组均采用离体大鼠心脏灌流模型方法，全心停灌30 min，复灌60 min，制成心肌缺血再灌注模型，对B、C、D三组在再灌注初始时，均先给予再灌注10 s，全心停灌10 s，共6次循环的缺血后适应干预。测定左室收缩压(LVSP)和再灌30 min冠状动脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的含量。分离左室心肌并测定心肌梗死面积，对心肌进行免疫组织化学染色测定磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)和磷酸化糖原合成酶激酶(GSK-3β)的表达。结果D组与C组相比，锌干预的离体DM大鼠心脏缺血后适应可显著改善再灌注后LVSP以及左心室内压最大上升速率(+dP/dtmax)等血流动力学指标，并显著减少了再灌注后LDH与CK的释放量；同时缺血后适应干预减少了心肌梗死的面积,P-Akt及P-GSK-3β的表达增加。C组与A组相比，对DM大鼠给予缺血后适应处理后，其血流动力学无明显改善，且心肌酶释放量未减低，同时也没有显著减少心梗面积，P-Akt,P-GSK-3β的表达减少。结论锌干预的离体大鼠心脏恢复或增强了缺血后适应对DM大鼠心肌再灌注损伤的保护作用，其机制与锌使DM大鼠心肌细胞内P-Akt及P-GSK-3β增强，进而使缺血后心肌梗死面积减小和心肌酶释放量减少有关。

关键词〔〕锌；糖尿病；缺血后适应；再灌注损伤；P-Akt；GSK-3β

中图分类号〔〕R541〔文献标识码〕A〔

通讯作者：赵昕(1964-)，男，教授，主要从事糖尿病心肌病与缺血再灌注损伤的研究。

第一作者：路航(1987-)，男，在读硕士，主要从事糖尿病心肌病与缺血再灌注损伤的研究。

糖尿病(DM)为冠心病的高危因素，DM人群中心肌梗死的发生率是非DM人群的2～6倍，其再灌注治疗后发生心肌再灌注损伤的比例也明显增高〔1〕，2/3左右的DM患者死因为心血管疾病〔2〕。目前急性心肌梗死治疗原则是通过溶栓或冠脉介入(PCI)开通病变血管来挽救心肌细胞，但再灌注治疗引起的再灌注损伤值得关注，Zhao等〔3〕首次将缺血再灌注心肌的保护作用命名为缺血后适应。同时已有很多研究证实DM使缺血后适应预防心肌缺血发生再灌注损伤的作用减弱或消失，但用何种方法能干预激活再灌注损伤救援信号传导途径具有更大的临床指导意义。本研究旨在探讨锌对DM大鼠心肌的缺血后保护作用的影响和机制。

1材料与方法

1.1材料乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒购于南京建成生物研究所，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(P-Akt)、糖原合成酶激酶(GSK)-3β、磷酸化GSK(P-GSK)-3β抗体购于美国Cell Signaling 公司。

1.2实验动物与分组40只清洁级雄性Wistar大鼠，体重180～250 g，由吉林大学白求恩医学部公卫医学院实验动物中心提供。将大鼠随机分为正常大鼠缺血再灌注组(A 组)，正常大鼠缺血后适应组(B 组)，DM大鼠后适应组(C 组)，ZnSO4干预DM大鼠后适应组(D组)，每组10只。

1.3DM大鼠模型建立方法给予成年雄性Wistar 大鼠高脂饲料喂养28 d建立胰岛素抵抗模型，然后给予大鼠2%链脲佐菌素(STZ)(40 mg/kg) 一次性腹腔注射，给药7 d后，检测血糖>16.7 mmol/L为DM大鼠模型成功，大鼠继续喂养4 w。

1.4大鼠心脏离体灌注给予大鼠10%水合氯醛腹腔注射,然后腹腔注射肝素500 U抗凝，取出大鼠心脏，将离体大鼠心脏浸于4℃Krebs-Henseleit缓冲液(成分：118 mmol/L氯化钠，25 mmol/L碳酸氢钠，1.2 mmol/L磷酸二氢钾，4.7 mmol/L氯化钾，3.0 mmol/L氯化钙，1.2 mmol/L硫酸镁，11 mmol/L葡萄糖，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸，pH7.4)中，1 min内主动脉插管悬挂于Langendorff装置上，用改良Krebs-Henseleit缓冲液行非循环式主动脉逆行灌流，灌流压65 mmHg,灌流液温度维持在37℃，pH7.4,灌流液以95%氧气，5%二氧化碳混合气饱和。A组经历全心停灌缺血30 min，60 min 复灌再灌注期；B、C、D三组全心停灌缺血30 min后，再灌注开始前先给予再灌注10 s，全心停灌缺血10 s，共6次循环的缺血后适应处理，然后继续给予再灌注至60 min。

1.5血流动力学测心功能将1个连接于压力换能器的球囊插入左心室,连接囊的导管内充满生理盐水(事先应排尽空气)，压力换能器的另一端接于八道生理记录仪RM-6000，由其来记录左心室内压力的变化，分别于缺血前平衡期，再灌期30 min记录左心室收缩压(LVSP)、心率(HR)、左心室内压最大上升速率(+dP/dtmax)。

1.6冠脉流出液LDH和CK含量测定收集平衡灌流20 min、再灌注30 min的冠脉循环流出液，半自动分光光度仪测定LDH及CK含量。

1.7心梗面积测定再灌注60 min后迅速取下离体大鼠心脏，分离左心室心肌并将其横切成五片，置入氯化三苯基四氮唑(TTC)中，37℃水浴15 min，置入10%中性甲醛固定过夜，然后分离坏死区和非坏死区后称重(非坏死区染成砖红色，坏死区呈灰白色)，梗死范围以坏死心肌质量占左心室心肌质量的百分比表示。数码照相后用IMAGE TOOL电脑软件分析梗死范围。

1.8免疫组化染色石蜡包埋组织切片，常规脱蜡至水，以3% H2O2室温孵育5～10 min，蒸馏水洗3次；枸橼酸盐缓冲液中微波修复抗原，冷却后，0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗1～2次；5%～10%正常山羊血清封闭非特异性抗原，室温孵育20 min，甩去多余液体，不洗；分别滴加适当稀释的特异性一抗，4℃过夜；根据一抗的不同，滴加相应二抗(IgG/Biotin)，室温孵育40 min，PBS洗3次，5 min/次；滴加相应辣根过氧化物酶(S-A/HRP)工作液，室温孵育20 min，PBS洗4次，5 min/次；二氨基联苯胺双氧水(DAB-H2O2)显色，室温5～30 min，蒸馏水洗涤；苏木素复染，中性树脂封片；显微镜下拍摄切片图形。

2结果

2.12型糖尿病(T2DM)大鼠模型指标正常大鼠进食，饮水量正常,情绪稳定,毛色白而有光泽。高脂饮食组给予2%STZ腹腔内注射后 ，饮水量较造模前明显增加,精神萎靡,毛色发黄，无光泽，尿量增加明显，给予2%STZ腹腔内注射第7天，DM组血糖明显高于正常组，体重下降高于正常组(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血糖以及体重比较( ± s， n=20)

2.2血流动力学指标比较B组再灌注30 min HR、LVSP、+dP/dtmax恢复明显高于A组(P<0.05)。 C组与A组无显著差别(P>0.05)，D组血流动力学指标比A组及C组明显改善(P<0.05)。见图1。

2.3冠状动脉流出液LDH、CK含量再灌注30 min，与平衡期相比，正常大鼠各组冠脉流液中LDH、CK含量升高显著，B组再灌注30 min脉流液中LDH、CK含量明显低于A组(P<0.05)。C组再灌注30 min脉流液中LDH、CK含量与A组差别无统计学意义(P>0.05)，D组LDH、CK含量明显降低(P<0.05)。见图2。

2.4心肌梗死范围B组心梗面积比A组面积减少(29.50%±3.4% vs 45.65%±4.8%，P<0.01)。C组心梗面积(50.12%±3.7%)与A组心梗面积无统计学差异(P>0.05)，D组心梗面积(31.10%±3.4%)比C组显著减小，差异有统计学意义(P<0.05)。

与A组比较：1)P<0.05；与C组比较：2)P<0.05，下图同 图1　各组血流动力学指标

图2　再灌注前后各组心肌酶释放

2.5免疫组化染色B组P-Akt、P-GSK-3β表达明显强于A组；C组表达均明显弱于B组，而与A组比较无明显差别，D组较C组明显增强。见图3。

A 组 P-Akt

A组 P-GSK-3β

B组 P-Akt

B组 P-GSK-3β

C组 P-Akt

C组 P-GSK-3β

D组 P-Akt

D组 P-GSK-3β

3讨论

目前，缺血预适应处理对DM缺血心肌发生再灌注损伤的保护作用减弱的机制研究尚不清楚，后适应与预适应的心肌保护作用机制相近，均与再灌注损伤救援激酶(RISK)信号传导通路有关〔4〕。已有一些实验研究证实预适应对于DM心肌无保护作用〔5〕。本实验说明DM心肌的代谢状态，使Akt磷酸化水平降低，导致GSK-3β 的磷酸化水平发生降低，进而使得心肌缺血后适应保护机制发生作用的RISK信号传导通路受损，DM缺血后适应保护作用减弱。

锌是生物体内必需的金属元素，发挥多种生物学效应，其中在抗细胞凋亡过程中起到重要作用〔6〕。锌在直接作用于PI3K-Akt信号传导通路级联反应的初始阶段，通过下调蛋白酪氨酸磷酸化酶(PTPase)的活性，使对Akt2激活的抑制作用减弱，Akt磷酸化增强，进而导致GSK-3β 的磷酸化水平发生降低，心肌细胞的保护作用得以实现〔7〕。从实验中注意到：锌作为GSK-3β 抑制剂在DM心肌缺血再灌注损伤过程中具有明确的心肌保护作用，但是其确切机制还需进一步的研究。

4参考文献

1Juutilainen A,Lehto S,Ronnemaa T,etal.Type 2 diabetes as a "coronary heart disease equivalent":an 18-year prospective population based study in Finnish subjects〔J〕.Diabetes Care,2005;28(12):2901.

2Ali Raza J,Movahed A.Current concepts of cardiovascular diseases in diabetes mellitus〔J〕.Int J Cardiol,2003;89(2-3):123-34.

3Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,etal.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003;285(2):H579-88.

4Hausenloy DJ,Yellon DM.Survival kinases in ischaemic preconditioning and postconditioning〔J〕.Cardiovasc Res,2006;70(2):240-53.

5Nieszner E,Posa I,Kocsis E,etal.Influence of diabetic state and that of different sulfonylureas on the size of myocardial infarction with and without ischemic preconditioning in rabbits〔J〕.Exp Clin End Diabetes,2002;110(5):212-8.

6Chimienti F,Aouffen M,Favier A,etal.Zinc homeostasis-regulating proteins:new drug targets for triggering cell fate〔J〕.Curr Drug Targets,2003;4(4):323-38.

7Chanoit G,Lee S,Xi J,etal.Exogenous Zinc protects cardiac cells from reperfusion injury by targeting mitochondrial permeability transition pore through inactivation of glycogen synthase kinase-3beta〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008;295(3):H1227-33.

〔2014-06-11修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)