虫草多糖对哮喘模型大鼠血清白细胞介素-17和IgE水平动态变化的影响

吴海弟刘礼荣陈永倖

(海南省人民医院呼吸内科，海南海口570311)

摘要〔〕目的研究虫草多糖对哮喘模型大鼠血清白细胞介素(IL)-17和IgE水平动态变化的影响。方法选取SPF级雄性SD大鼠80只，随机分为两组，其中实验组60只，给予50 μg卵清蛋白(OVA)+150 μl氢氧化铝干粉+50 μl生理盐水腹腔注射，建立支气管哮喘大鼠模型，正常对照组20只，予等量生理盐水灌胃；造模成功过后，将实验组随机分为模型组30只和虫草组30只。虫草组大鼠予150 mg/kg虫草多糖每日一次灌胃，连续14 d；模型组大鼠给予等量的生理盐水每日一次灌胃，连续14 d。实验结束后，对比实验前后各组大鼠血清IL-17和IgE水平、支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞比例、嗜酸性粒细胞比例及总细胞数。结果①实验组大鼠的血清IL-17含量明显高于正常对照组(P<0.05)；治疗后，虫草组大鼠血清IL-17含量与模型组(13.01±1.65)比较明显较低(P<0.05)；②实验组大鼠血清IgE含量明显高于正常对照组(P<0.05)；治疗后，虫草组大鼠血清IgE含量与模型组比较明显较低(P<0.05)。③实验组大鼠肺泡灌洗液细胞总数、中性粒细胞比例以及嗜酸性粒细胞比例均明显高于正常对照组(P<0.05)；治疗后，虫草组大鼠肺泡灌洗液细胞总数、中性粒细胞比例以及嗜酸性粒细胞比例明显低于模型组(P<0.05)。④大鼠血清IL-17与IgE水平存在明显的正相关关系(r=0.963，P<0.01)。结论虫草多糖能够明显降低哮喘模型大鼠血清IL-17和IgE水平，减轻炎症反应。

关键词〔〕虫草多糖；哮喘；白细胞介素-17；IgE

中图分类号〔〕R562.2+5〔文献标识码〕A〔

第一作者：吴海弟(1980-)，男，硕士，主治医师，主要从事呼吸系统疾病基础与临床研究。

支气管哮喘是由中性粒细胞、肥大细胞、T嗜酸性粒细胞、嗜酸性粒细胞等多种免疫细胞参与而引起的一种气道慢性炎症性疾病〔1〕。本病临床表现为气道高反应而引起的气喘、胸闷、咳嗽、呼吸困难等症状，严重者可出现低氧血症，甚至危及生命〔2〕。中医属“哮病”的范畴。随着分子生物学技术的发展，本病人们更加重视疾病防治及预后，现代医学多采取扩张支气管、激素类药物抗炎等对症疗法〔3〕，但只能暂时控制病情发展，而且激素类药物存在免疫力下降、体态改变、骨质疏松等副作用，治疗效果并不理想，亟需寻找治疗哮喘的新思路。研究发现，哮喘属于变态反应性疾病，发生过程中有大量的免疫细胞参与，与机体免疫功能的改变密切相关〔4〕，虫草多糖能够止咳、化痰、改善呼吸系统，能够提高人体免疫力〔5〕，但关于其治疗哮喘的实验研究较少，为了增强疗效，缓解痛苦，改善哮喘患者预后。本文观察虫草多糖对急性哮喘模型大鼠血清白细胞介素(IL)-17和IgE水平。

1对象与方法

1.1实验动物与分组选取成年的SPF级雄性SD大鼠80只(由辽宁中医药大学动物实验室提供)，体重(280±20)g。将大鼠随机分为2组，实验组60只，正常对照组20只。给予安静、温暖、光照适合、通风良好的饲养环境，保持室内温度20℃左右，湿度设定在40%～60%，投喂标准饲料，让其自由进食，调节光照，昼夜节律正常。

1.2主要试剂和仪器卵清蛋白(OVA，北京索莱宝科技有限公司)；氢氧化铝干粉(沈阳化工厂)；虫草多糖(含量90%，由云南省微生物所提供)；大鼠IL-17抗体试剂盒和大鼠IgE抗体试剂盒(上海凯博生化试剂有限公司)；PBS漂洗缓冲液(BOSTER公司)；离心机(美国贝克曼库尔特公司)；DW-86W100超低温冰箱(青岛海尔)；SpectraMax M5酶标仪(美国Molecular Devices)；光学显微镜(美国应用生物系统公司)。

1.3造模方法两组大鼠均正常适应性饲养5 d，之后于第0天、第7天、第14天，分别给予实验组大鼠腹腔注射致敏剂(50 μg OVA+150 μl氢氧化铝干粉+50 μl生理盐水，制成混悬液)，正常对照组给予等量生理盐水腹腔注射；第7天，给予实验组大鼠皮下注射10 g/L OVA溶液，以增强过敏反应，正常对照组给予等量生理盐水腹腔注射；第14天开始每日一次雾化吸入OVA溶液(10 g/L)，每次持续30 min，连续4 d；正常对照组予雾化吸入等量生理盐水。实验组大鼠出现呼吸急促、喷嚏、不安、口唇发绀、毛发干枯等表现即为造模成功，实验组大鼠全部造模成功。

1.4实验方法及标本采集造模成功后，将模型组大鼠随机分为模型组30只和虫草组30只。虫草组大鼠予150 mg/kg虫草多糖每日一次灌胃，连续14 d；模型组大鼠给予等量的生理盐水每日一次灌胃，连续14 d；各组小鼠均正常饲养。造模前后及治疗后，分别从各组大鼠的眼眶抽取静脉血3 ml，利用离心机3 000 r/min离心，取上清液，分成两部分，分别置于4℃和-80℃冰箱中保存备用。静脉血采集完成后，处死大鼠，迅速阻断左侧支气管，采用PBS液对右侧支气管进行灌洗，反复3次，抽吸收集灌洗液备用。

1.5观察指标及检测方法

1.5.1酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清IL-17、IgE含量取出-80℃保存的血清测定IL-17含量，严格按照ELISA试剂盒的说明书操作，将血清和试剂在室温下放置30 min→将50 μl样本、标准品滴加到酶标板上→90 min后，孔内滴加大鼠IL-17抗体工作液0.1 ml→置入37℃保温箱中1 h→采用PBS进行洗涤，反复3次后→滴加酶标工作液(0.1 ml/孔)→置入37℃保温箱中1 h→ 200 μlPBS液洗涤，反复5次→滴加50 μl显色液TMB→培育30 min，至标准品蓝染→滴加TMB终止液0.1 ml，可见蓝色变为黄色→利用450 nm酶标仪测定光密度(OD)值→计算样品IL-17含量。取出4℃保存的血清按照以上步骤测定血清IgE含量。

1.5.2肺泡灌洗液中总细胞数目、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞比例测定取出收集的肺泡灌洗液，利用离心机3 000 r/min离心5 min，弃上清，沉渣中加入PBS液制成悬浊液，涂于载玻片上，95%乙醇固定后进行HE染色，于光镜下观察总细胞数目，并计算中性粒细胞比例以及嗜酸性粒细胞比例。

1.6统计学方法采用SPSS19.0进行t检验及χ2检验；相关性采用线性相关分析。

2结果

2.1治疗前后各组大鼠血清IL-17水平比较实验组大鼠的血清IL-17含量明显高于正常对照组(P<0.05)；治疗后，虫草组大鼠的血清IL-17含量，与模型组(13.01±1.65)比较明显较低(P<0.05)，见表1。

表1　治疗前后各组大鼠血清IL-17、IgE水平及肺泡灌洗液细胞数比较( ± s)

与正常对照组比较:1)P<0.05；与模型组治疗后比较:2)P<0.05

2.2治疗前后各组大鼠血清IgE水平比较实验组大鼠血清IgE含量明显高于正常对照组(P<0.05)；治疗后，虫草组大鼠血清IgE含量与模型组比较明显较低(P<0.05)，见表1。

2.3各组大鼠肺泡灌洗液细胞总数、中性粒细胞比例及嗜酸性粒细胞比例比较实验组大鼠肺泡灌洗液细胞总数、中性粒细胞比例及嗜酸性粒细胞比例均明显高于正常对照组(P<0.05)；治疗后，虫草组大鼠肺泡灌洗液细胞总数、中性粒细胞比例以及嗜酸性粒细胞比例明显低于模型组(P<0.05)，见表1。

2.4哮喘大鼠血清IL-17与IgE水平的相关性哮喘大鼠血清IL-17与IgE水平呈正相关(r=0.963，P<0.01)，见图1。

图1　哮喘血清IL-17与IgE水平相关性

3讨论

支气管哮喘与遗传、过敏源、环境污染等多种因素有关〔6〕，是由多种炎性细胞及细胞因子参与的气道高反应性疾病。近年来，随着环境及生活方式的改变，支气管哮喘的发病率不断增加，以其发病急、临床表现重、易反复等特点〔7〕，严重影响人们的生命健康和生活质量，而目前的激素类药物对症治疗副作用较大，临床效果并不理想。有研究发现〔8〕，哮喘模型大鼠体内存在Th1/Th2细胞的失衡，Th17细胞增多，同时各种相关细胞因子含量也升高，免疫功能异常，为支气管哮喘的治疗提供了新思路。虫草多糖提取自古老的中药冬虫夏草，中医认为，冬虫夏草性温，味甘，具有补虚损、益精气、止咳化痰之功〔9〕，现代临床研究亦证实，虫草多糖在治疗呼吸系统疾病、提高免疫力方面具有良好的临床疗效〔10〕。

本研究显示，哮喘大鼠血清IL-17、IgE含量明显高于正常大鼠；治疗后，虫草组大鼠的血清IL-17、IgE含量与模型大鼠比较明显较低。IL-17是一种多功能的细胞因子〔11〕，能够促进中性粒细胞发育，放大气道的炎症反应，促进哮喘发作；IgE可以促使嗜酸性粒细胞增多〔12〕，加重哮喘发作。IL-17和IgE起到相辅相成的作用，这与本研究结果相同。本研究结果提示虫草多糖可以通过降低IL-17、IgE水平，从而降低哮喘反应程度，虫草多糖能够使中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞的含量降低，减轻炎症反应，这可能与其降低IL-17、IgE水平有关。

总之，虫草多糖能够明显降低哮喘模型大鼠血清IL-17和IgE水平，减轻炎症反应，对临床具有指导意义，值得临床推广。

4参考文献

1中华医学会呼吸病学分会哮喘学组.支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗和管理方案)〔J〕.中华结核和呼吸杂志,2008;31(3):177-85.

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4陈慧中,朱春梅.支气管哮喘的免疫学发病机制〔J〕.实用儿科临床杂志,2004;19(12):1015-7.

5罗兆永.中医治疗支气管哮喘的疗效观察——附307例疗效分析〔C〕.全国第六届中西医结合呼吸病学术研讨会论文汇编,2002:69-71.

6Wang L,Du YC,Xu JY.Evaluation of quality of life in patients with bronchial asthma and influence factors analysis of 〔J〕.Int J Biotechnol,2011;31 (15):1165-8.

7薛培丽,曾凤英,聂丹丹,等.支气管哮喘患者吸入激素治疗依从性分析〔J〕.现代预防医学,2007;34(15):2970-1.

8 韩诗淼,崔雁辉.支气管哮喘患者外周血单核细胞因子Th1/Th2失衡的检测〔J〕.中国基层医药,2007;14(3):439-40.

9陈晓燕.冬虫夏草的药理与临床研究进展〔J〕.中医药导报,2009;15(2):91-3.

10廖东江,卢心鹏,赵瑾,等.人工冬虫夏草在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的治疗作用和机制研究〔J〕.国际呼吸杂志,2012;32(13):969-973,封3.

11Xu M,Wu KS.IL-17 family and chronic inflammatory disease of airway 〔J〕.Int J Immunol,2013;36 (1):45-8.

12吴红梅,于莹,张莉,等.支气管哮喘患儿血清总IgE、TNF-α检测及其临床意义〔J〕.中国实验诊断学,2010;14(8):1244-6.

〔2013-12-21修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)