王正尧，吴金香，尤柳霞，蔡俊峰

（福建医科大学附属第二医院检验科，福建泉州362000）

辅助生殖技术中锌对精子的保护作用

王正尧，吴金香，尤柳霞，蔡俊峰

（福建医科大学附属第二医院检验科，福建泉州362000）

目的：探讨辅助生殖技术中锌保护精子损伤的作用．方法：应用精子密度梯度离心的方法进行精子优选，优选的精子分为空白对照组、过氧化氢处理组和实验组，实验组受过氧化氢刺激同时加入锌，培养5h后比较3组精子的存活率、活力、精子质膜完整性及精子DNA碎片．结果：过氧化氢刺激后精子的存活率、活力差，精子质膜完整性破坏，大量精子DNA损伤，而锌能明显保护精子质量的作用．结论：在辅助生殖技术中锌可抑制精子损伤，从而提高精子质量的作用．

精子；活性氧；辅助生育技术；精子质量

辅助生育技术（assisted reproductive technology，ART）中精子体外优选处理、冷冻及复苏过程中导致的精子损伤影响着精液常规的各项指标［1］．目前国内外ART成功率仅50%左右，提高精子质量与胚胎质量，可提高ART中妊娠的成功率．锌是男性体内精子生长发育过程中不可缺少的微量元素．大量研究表明，体内锌具有保护精子的作用［2－4］．本研究在优选后的精子中加入适量的锌，通过比较精子的存活率、活力以及精子低渗肿胀实验和精子DNA碎片检测判断锌能否抑制精子的损伤作用，旨在判断ART中锌能否改善精子质量作用．

1 材料和方法

1．1 材料

10例正常健康男性精液样品，取自福建医科大学附属第二医院有生育能力的青年自愿者，年龄25～30岁，平均（26±2）岁．ZnCl2为瑞士Adamasbeta公司产品；体积分数为30%H2O2由西陇化工股份有限公司提供；体积分数为40%上层梯度离心液、体积分数为80%下层梯度离心液及洗精液均购自美国Quinn's公司；精子DNA碎片检测试剂盒购于深圳博锐德生物科技有限公司；精子质量分析系统为北京国联医疗技术有限公司产品；Olympus CX31型光学显微镜为日本Olympus公司生产．

1．2 方法

（1）精子活力与存活率的分析 10份精液标本，置37℃水浴箱待液化，分别用体积分数为40%和80%高密度离心液制备梯度液300 g 15 min获取优质精子，Quinn’s洗精液300 g 5min洗涤优质精子2次后将精子密度调至5．0×109～1．0×1010／L，每份0．3 mL平均分为3组：ZnCl2＋H2O2组含质量浓度为1．7 μg／mL ZnCl2及体积分数为0．001%的H2O2；H2O2组含体积分数为0．001%H2O2；空白组加入等量体积分数为0．9%NaCl2．3组同时置37℃体积分数为5%C02孵箱中孵育5 h后，用国联精子检测系统观察精子运动功能的变化．

（2）精子质膜完整性的判断 应用低渗膨胀实验来评估精子质膜的完整性：3组同时置37℃体积分数为5%C02孵箱中孵育5 h后，分别取100 μL样品置100 μL无菌蒸馏水中静置5 min后，各取10 μL于洁净载玻片，并覆盖上盖玻片，400倍镜下随机选取视野观察，计数200个精子，按以下公式计算出质膜完整精子百分率：

（3）精子DNA碎片的检测 本实验采用精子染色质扩散法进行检测：3组同时置37℃体积分数为5%CO2孵箱中孵育5 h后，分别取60 μL，参照精子DNA检测说明进行操作．DNA完整的精子在经过变性和去掉核蛋白后DNA扩散形成特征性的光晕，而存在DNA碎片的精子不会产生特征性的光晕．根据光晕的有无和大小判断精子DNA的完整程度．精子DNA碎片判断标准：精子头部仅产生较小的光晕或无光晕，单侧光晕的厚度不超过精子头部最小直径的1／3（图1）．400倍镜下随机选取视野观察，计数500个精子，按以下公式计算出存在DNA碎片精子百分率：

图1 精子DNA碎片检测示意图Fig．1 Sperm DNA fragmentation detection schematic diagram

1．3 应用SPSS 20．0软件进行统计分析，多组的均数比较采用随机区组设计的方差分析，组间两两比较采用LSD法，双侧检验，P＜0．05有统计学差异．

2 结果

2．1 锌保护优选后精子活力与活率作用

10例正常健康男性精液经ART中精液优化处理后在H2O2作用下精子运动能力显著下降，明显低于同时加入适量ZnCl2的实验组（表1）．

表1 锌保护优选后精子活力与存活率作用（±s）Table 1 The function of zinc in protecting selected sperm motility and viability（±s）

表1 锌保护优选后精子活力与存活率作用（±s）Table 1 The function of zinc in protecting selected sperm motility and viability（±s）

1）与对照组相比较，P＜0．001；2）与对照组相比较，P＜0．001；1）与2）相比较，P＜0．001．

组别n／例精子活力（a＋b）／%精子存活率／%对照组1077．77±4．8992．50±2．13 ZnCl2＋H2O21026．14±2．561）51．47±5．08 H2O2103．43±1．062）20．51±3．76

2．2 锌抑制优选后精子质膜的损伤作用

10例正常健康男性精液经ART中精液优化处理后H2O2具损伤精子质膜的作用，且损伤程度明显高于同时加入适量ZnCl2的实验组（图2、表2）．

2．3 锌对优选后精子DNA的保护作用

10例正常健康男性精液经ART中精液优化处理后在H2O2刺激下精子DNA完整性严重破坏，DNA损伤程度明显高于同时加入适量ZnCl2的实验组（图3、表3）．

图2 精子质膜完整性Fig．2 sperm plasma membrane integrity

图3 精子DNA完整性Fig．3 Sperm DNA integrity

表2 锌抑制优选后精子质膜的损伤作用（χ—±s）Table 2 Zinc inhibited the injury of selected sperm plasma membrane(±s）

表2 锌抑制优选后精子质膜的损伤作用（χ—±s）Table 2 Zinc inhibited the injury of selected sperm plasma membrane(±s）

1）与对照组相比较，P＜0．001；2）与对照组相比较，P＜0．001；1）与2）相比较，P＜0．001．

组别n／例精子质膜完整率／%对照组1093．90±1．67 ZnCl2＋H2O21058．90±3．411）H2O21025．50±4．772）

表3 锌对优选后精子DNA的保护作用（±s）Table 3 Zinc protected DNA of selected sperm（±s）

表3 锌对优选后精子DNA的保护作用（±s）Table 3 Zinc protected DNA of selected sperm（±s）

1）与对照组相比较，P＜0．001；2）与对照组相比较，P＜0．001；1）与2）相比较，P＜0．001．

组别n／例精子DNA完整率／%对照组1098．79±0．42 ZnCl2＋H2O21055．07±2．951）H2O21019．28±1．342）

3 讨论

近年国内外学者研究发现精子结构和功能改变，造成精子的质量降低［5－7］．当男性生殖系统发生缺氧、炎症以及ART前期对精子的离心、冷冻及复苏等会产生高水平的过氧化物，超过了精子自身抗氧化系统的清除能力，从而导致精子质膜的过氧化和DNA损伤．Villani等［7］应用过氧化氢和脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）对人、老鼠和公牛3个物种的精子进行处理研究，结果表明3物种精子DNA碎片损伤与过氧化氢和DNase酶密切相关，而人的精子对DNase酶的敏感性最高．男性精子DNA碎片化造成精子内部遗传信息的不完整，严重影响生育情况，会导致不孕，反复流产，胎儿畸形，胎儿发育停滞，辅助生殖失败等．目前国内外大量的研究表明：精子DNA碎片化形成可能与炎症、凋亡、氧化损伤以及环境因素等多种因素作用相关［8－10］．

锌是人体重要的必须微量元素，在男性前列腺、睾丸及精浆中含量较高，对男性生殖具有重要作用．锌作为体内200多种酶的辅助因子，与生殖系统的代谢密切相关，精浆中适量的锌能够促进精子核成熟，提高精子质量，其含量降低将影响精子的发生、发育、成熟和受精过程，使精液密度和存活率下降，降低精子质量，从而使受精能力降低［11］；锌具有抗氧化能力，可延缓细胞膜的脂质氧化，以维持细胞结构的稳定性和生理通透性，其缺乏可导致机体抗氧化能力降低，影响精子运动，使精子DNA损伤［12］；Juriy等［13］研究Ca2＋与Mg2＋依赖的DNase在中间球海胆（sea urchin strongylocentrotus intermedius）精子中的活化并激活半胱天冬酶（caspases）系统降解精子DNA的机制，指出锌可以阻断DNase降解中间球海胆精子DNA的作用，从而减少中间球海胆精子DNA碎片的作用．锌还具有免疫抗炎作用，是前列腺中重要的抗感染因子；精浆中适量的锌对男性生育的诊断及治疗有一定指导作用．

已经发展30多年的ART，可促进精液液化，通过各种方法去除精液中的白细胞、死精子以及部分畸形精子等，达到精子优选的目的，但无法去除DNA损伤的精子．目前在ART中人们通常使用的精子培养基是模拟输卵管液，尚未知在培养基中加入适量的锌对精子是否对外界损伤的保护作用．本研究主要采用ART中优选的精子为实验对象，以过氧化氢为损伤刺激物，通过适量的ZnCl2进行干预，在国联精子软件分析、低渗肿胀实验以及精子DNA碎片检测来判断锌能否抑制过氧化氢对精子的损伤刺激作用，从而提高精子质量的目的．本实验结果显示，在ART中适量的锌能抑制过氧化氢对精子的损伤作用，不仅提高精子的存活率及活动力，还能保护精子质膜与精子DNA完整性作用，从而提高精子质量．在本研究中体外培养基中Zn2＋质量浓度远低于精浆中的Zn2＋质量浓度，主要是Zn2＋在体内不同部位的质量浓度分布不一，ART中应用的培养基主要是参照输卵管液，可见在输卵管位置Zn2＋的质量浓度明显少于精浆．本实验组将进一步研究锌是否通过质膜离子通道维持细胞的结构稳定性和生理通透性，还是通过抑制caspases系统阻断DNase降解精子DNA从而保护精子质量的作用．锌能抑制过氧化氢损伤精子质量的具体机制还有待进一步研究．

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［责任编辑：朱颖嫄］

Zinc protects sperm quality in assisted reproductive technology

WANG Zhengyao，WU Jinxiang，YOU Liuxia，CAI Junfeng
（Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Quanzhou 362000，China）

Aim：To study the action of zinc that reduces sperm damage in assisted reproductive technology．Methods：The preferred sperms selected by density gradient centrifugation were divided into blank control group，hydrogen peroxide-treated group，and experimental group which was treated with both hydrogen peroxide and Zinc；The three groups were compared in sperm motility，viability，sperm plasma membrane integrity，and sperm DNA fragmentation after 5h incubation．Results：The sperm motility and vitality decreased，the membrane integrity was destroyed，and the sperm DNA was damaged after the sperms were incubated with hydrogen peroxide．However，Zinc could protect the sperms from the damage significantly．Conclusion：Zinc reduces sperm damage in the assisted reproductive technology，and thereby improves the quality of sperm．

Sperm；reactive oxygen species；assisted reproductive technology；sperm quality

R321

A

1000－9965（2015）01－0029－05

10．11778／j．jdxb．2015．01．005

2014－06－17

福建省卫生厅青年科研基金项目（2011－1－36）

王正尧（1977－），男，主管检验师，研究方向：不孕不育检测及辅助生殖技术．Tel：0595－22768100，E－mail：wzy19770127＠163．com