王文博　谷晓红　苑学霞　李瑞菊　梁京芸　李鸳鸯

摘要：采用金黄色葡萄球菌测试片快速筛选的方法，对采集于陕西省西安市和渭南市20份样品中S.aureus进行分离鉴定及药物敏感性研究，以了解此地区生牛乳中S.aureus的污染情况及对药物敏感性。结果表明：S.aureus测试片可用于大量生牛乳样品中S.aureus的初筛工作，方便且省力；S.aureus的检出率为10%；检出的两株S.aureus对青霉素都为耐药，其中一株对磺胺异恶唑也表现为耐药，两株S.aureus对复方新诺明、红霉素、万古霉素、氧氟沙星、克林霉素都表现为敏感。牛场应根据药物敏感性实时调整抗感染药物的使用方案。

关键词：金黄色葡萄球菌；分离鉴定；药物敏感性；生牛乳

中图分类号：S879.1

文献标识号：A

文章编号：1001-4942（2015）10-0092-03

金黄色葡萄球菌是一种常见的革兰氏阳性病原菌，是引起反刍动物乳房疾病最普遍的致病菌，主要表现为奶牛和羊的临床和亚临床乳房炎。据报道，在奶牛场中，临床型乳房炎的发病率为2%～8%，隐性乳房炎的发病率更高，这种牛生产的生鲜乳是易被S.aureus污染的食品原料，并且S.aureus能产生高温灭菌不能破坏的肠毒素，将会严重影响消费者的身体健康。因此，对生牛乳中S.aureus的研究尤其是检测非常重要。随着抗生素的广泛使用，S.aureus对目前使用的各种抗生素可能产生一定程度的耐药，给奶牛乳房炎的治疗带来一定困难，所以及时掌握S.aureus的耐药性情况是防治该病的关键。

本试验以生牛乳为原料，以S.aureus为研究对象，采用S.aureus测试片进行快速筛选的方法，研究生牛乳中S.aureus的分离鉴定及药物敏感性，旨在为生牛乳中S.aureus的分离鉴定及药物敏感性分析提供一种方便、省力的检测方法，为及时防止由S.aureus引起的食源性疾病提供可靠的技术支持，也为原料奶的安全生产提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

生牛乳：采自陕西省西安市和渭南市，共20份样品。将采集的生牛乳放入冰盒中保存，并在12h内分离样品；S.aureus测试片：购自北京良润生物科技有限公司；S.aureus标准菌株[CMCC（B）26003]：购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心；药敏测试盒：购白天津金章科技发展有限公司；API staph试剂盒、葡萄球菌试剂盒，购自法国生物梅里埃公司。

主要培养基：7.5%氯化钠肉汤、S.aureus显色培养基、哥伦比亚血平板培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司。

主要仪器：APILAB Plus系统（法国生物梅里埃）；生化培养箱（购自上海新苗医疗器械制造有限公司）。

1.2方法

1.2.1生牛乳在S.aureus测试片上初步筛选无菌操作取25mL生牛乳于225mL灭菌生理盐水中，混匀；取1mL均匀放于S.aureus测试片中进行初筛，37℃培养24h，有蓝色菌落生长为可疑阳性，没有蓝色菌落生长为阴性。同时设空白对照。

1.2.2菌株的分离纯化及鉴定 取下有S.aureus可疑阳性菌落的测试片，置于无菌7.5%氯化钠肉汤中，37℃培养24h。取一菌环肉汤划线于金黄色葡萄球菌显色培养基中，37℃培养24h，紫红色为可疑菌落。挑取紫红色可疑菌落，划线于哥伦比亚血平板培养基，37℃培养24h。从哥伦比亚血平板上取菌落做成0.5个麦氏浓度的均匀菌悬液，填充API试剂条中，37℃培养24h，加入APILAB Plus系统判读。

1.2.3药敏试验 采用微量肉汤稀释法，试验方法及结果判定按美国临床实验室标准化委员会（CLSI）2015年标准进行。

2结果与分析

2.1生牛乳在S.aureus测试片上初步筛选结果

陕西省西安市和渭南市20份生牛乳在S.aureus测试片上培养24h后发现，有3份样品测试片出现蓝色斑点，判断为S.aureus阳性疑似菌落，菌落颜色明显，界线清晰，与空白对照和阴性测试片差异明显，筛查结果明显且直观，如图1所示。

2.2菌株分离及生理生化鉴定

将3份有可疑菌落的测试片进一步培养、分离、纯化，最终通过APILAB Plus判定为：S.aureus 2株，鉴定结果分别为：SX1%ID=97.8%，T=1.00；SX2%ID=98.1%，T=0.9；木糖葡萄球菌（S.xylosus）1株；S.aureus的检出率为10%。结果表明，取下阳性快检测试片后，采用与国标相同的培养基进行培养、分离、纯化，结果可以很好地满足生化鉴定的需要。

2.3药敏试验结果

采用目前国际通用的美国临床实验室标准化委员会（CLSI）2015年标准规定的微量肉汤稀释法和结果判定方法，对分离得到的2株S.aureus进行药敏试验，结果见表1。表明，在7种抗生素中，两株S.aureus对青霉素及SX2对磺胺异恶唑表现为耐药，其他则表现为敏感。

3讨论与结论

生牛乳中S.aureus的筛选分离通常按照GB4789.10-2010的方法，先将所有样品富集培养，再在选择性培养基上进行分离鉴定，工作量大，消耗人力、物力多。何源等对重庆市生牛乳中S.aureus的污染状况调查、薛秀恒等对安徽生牛乳中S.aureus的污染状况调查均采用以上方法。本试验用S.aureus测试片进行初筛，培养的样品由20个减少到3个，减少了后续培养的数量；操作方法只是将1mL稀释10倍的样品加到测试片上培养即可，操作非常简便。该测试片对S.aureus的识别率为100%，对非葡萄球菌属的抗干扰能力良好。对葡萄球菌属的检测发现，测试片对木糖葡萄球菌的抑制率约为80%。所以测试片上显色的菌落仍需后续鉴定（以上数据由北京良润生物科技有限公司提供）。在本试验中经过测试片初筛后得到的3个可疑菌株最后有一株鉴定为木糖葡萄球菌，与北京良润生物科技有限公司提供的数据吻合。说明本测试片不会出现假阴性，但可能会有假阳性出现。因此，本测试片可用于大量生牛乳样品的S.aureus的初筛工作，以减少工作量。

世界范围内，该菌在生牛乳中的检出率有国家和地区的差异，检出率在12%～79%不等，本试验中生牛乳中S.aureus的检出率为10%，这与重庆市（24.67%）、安徽省（16.7%）的研究结果差异较大，说明不同地区生牛乳中S.aureus污染状况不同。林柏玲等研究发现，上海和天津两个城市牛乳中S.aureus污染情况相差较大（上海为0，天津为26.09%），可能由于上海属于比较现代化的大都市，企业的生产管理制度均比较严格，牧场的生产条件和周边环境的要求较天津市高。这也说明只要对生产过程中每个环节进行严格监控，生牛乳的质量是可以得到保证的。

本试验中两株S.aureus对青霉素都为耐药，对复方新诺明、红霉素、万古霉素、氧氟沙星、克林霉素都为敏感，可能因为在奶牛场的养殖过程中青霉素长期单一使用。分离于不同奶牛场的S.aureus对所选7种抗生素的耐药性也不同，这与赵修龙等的研究结果一致，这主要与不同牛场的管理和预防性用药有关。本试验中复方新诺明、红霉素、万古霉素、氧氟沙星、克林霉素对两株菌都有良好的抗菌作用，建议用于此地区奶牛隐性乳房炎的防治。建议奶牛场建立细菌药敏动态数据库，根据药物敏感性，实时调整抗感染药物的使用方案，有针对性地选用药物，经常更换抗生素种类。endprint