张立华　董业成　张元湖

摘要：通过静态吸附与解吸试验对5种大孔吸附树脂进行筛选，结果表明：X-5型树脂对石榴花多酚表现出最好的吸附性能与解吸效果，适宜作为纯化石榴花多酚的树脂。通过单因素试验进一步优化X-5树脂对石榴花多酚的纯化条件，所得最佳上样条件为：上样液浓度3.1 g/L，pH值 2.0，上样液流速2 mL/min；最佳洗脱条件：洗脱液为70%乙醇溶液，洗脱流速为2 mL/min，洗脱体积为80 mL。

关键词：大孔吸附树脂；静态吸附；解吸；纯化；洗脱；石榴花；多酚

中图分类号： R284.2 文献标志码： B 文章编号：1002-1302（2015）10-0359-03

石榴5—7月开花，花期长，开花量大，不能结实的钟状花和部分筒状花会自然脱落，因此石榴花资源丰富，极具开发价值。石榴花中含有黄酮、多酚及三萜类等物质[1-2]，其中含量最丰富的是多酚，Kaur等报道石榴花乙醇提取物中的多酚含量达321.8 mg/g（以没食子酸为标准品）[3]。近年来，有大量研究表明，石榴花多酚不仅具有显著的抗氧化活性[4]，还具有抑制低密度脂蛋白和胆固醇的氧化[5]，防止动脉粥样硬化，降血压，降血脂[1]，抑制乳腺癌、前列腺癌和口腔癌等癌细胞增生[6-7]，减轻对肝组织的氧化损伤[3]等功能。因此，石榴花多酚在食品、化妆品和医药等领域有一定的应用前景。石榴花提取物中多酚总量与其多种生物活性呈明显的正相关性[4]，采用溶剂法提取的石榴花多酚还含有多种其他成分，因此需要对其进行纯化，才能提高其利用效率。目前，可用于植物多酚纯化的方法主要有溶剂萃取法[8]、重金属沉淀法[9]和树脂吸附法。萃取法须消耗大量三氯甲烷等有机溶剂，沉淀法须要消耗重金属，这2种方法容易导致产品中有机溶剂或重金属残留，而且产品收率较低。大孔树脂具有选择性强、吸附速度快、容量大、解吸容易、成本低等优点，近年来被用于分离纯化植物中的多酚[10]、黄酮[11]、花青素[12]等天然产物。然而，目前在还未见有关大孔吸附树脂法纯化石榴花多酚的研究报道。本研究从5种国产大孔树脂中筛选出 1种对石榴花多酚具有良好吸附和解吸性能的树脂，考察了该树脂对石榴花多酚的吸附与解吸性能及主要的影响因素，以期建立适宜的石榴花多酚纯化条件，为石榴花的深加工提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

石榴花采自山东省枣庄市石榴园，于鼓风干燥箱内 115 ℃ 杀青处理5 min，然后在80 ℃烘干至恒质量，粉碎后过孔径约380～400 μm筛，备用。经预处理过的D101、AB-8、DA201、DM130和X-5大孔吸附树脂由安徽三星树脂科技有限公司提供。

1.2 仪器与试剂

UV-2550 紫外可见分光光度计（日本岛津公司），旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂），玻璃层析柱（1.5 cm×20 cm），KQ-5200超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。没食子酸标准品为Sigma公司产品，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 分析方法

多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu试剂比色法，以没食子酸为标准品。

1.4 试验方法

1.4.1 石榴花多酚提取液的制备方法 石榴花干燥粉碎，超声波辅助提取（70%乙醇溶液，料液比1 g ∶ 20 mL，超声波功率80 W，温度30 ℃，处理时间40 min），过滤，弃去滤渣，回收滤液即为石榴花多酚提取液的母液，并用Folin-Ciocalteu法测定滤液中的多酚含量，不同含量的提取液由母液稀释配制。

1.4.2 树脂静态吸附与解吸试验 分别称取5种预处理过的大孔吸附树脂D101、AB-8、DA201、DM130和X-5各 2 g，置于100 mL的锥形瓶中，并加入50 mL多酚含量为 2.5 g/L 的石榴花粗提物样品液，在25 ℃恒温环境中吸附 12 h，取其中一定量的样品液用于测定其中的多酚含量；静态吸附后过滤除去石榴花粗提物溶液，树脂用蒸馏水洗净，放入100 mL的锥形瓶中，加入50 mL无水乙醇，于相同温度下解吸，取一定量解吸液测其中的多酚含量，以比较不同树脂对石榴花多酚的吸附和解吸特性。吸附量、吸附率、解吸率、回收率的计算公式：吸附量（mg/g）=（ρ0-ρe）×V0/m；吸附率=（ρ0-ρe）/ρ0×100%；解吸率=ρd/（ρ0-ρe）×100%；回收率=ρd/ρ0×100%。其中：ρ0表示提取物溶液中多酚含量，g/L；ρe表示上清液中多酚的含量，g/L；ρd表示解吸液的多酚含量，g/L；V0表示提取物溶液体积，mL；Vd表示解吸液体积，mL；m表示树脂质量，g。

1.4.3 树脂吸附条件的优化

1.4.3.1 上柱液 pH 值对吸附效果的影响 将预处理好的X-5树脂，装入1.5 cm×20.0 cm的层析柱中，层析柱高度（L）/层析柱内径（D）=13。用水洗涤平衡后上柱，上柱条件：流速3 mL/min，上样液中多酚含量2.5 g/L，上柱液体积V=160 mL，上柱液 pH 值分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0。检测漏出液多酚含量，考察上柱液 pH 值对树脂吸附石榴花多酚含量的影响。

1.4.3.2 上柱液浓度对吸附效果的影响 吸附条件：最佳 pH 值由“1.4.3.1”节确定，石榴花提取液中多酚含量经稀释分别调整为0.11、0.42、0.85、1.55、2.49、3.11、4.66、6.22 g/L，各50 mL，置于100 mL锥形瓶中，加入5 g预处理过的X-5大孔吸附树脂，25 ℃水浴吸附12 h，检测上清液多酚含量，计算X-5树脂对多酚的吸附量，考察上样液浓度对吸附量的影响，绘制静态吸附曲线。

1.4.3.3 X-5树脂的吸附动力学 按照“1.4.3.2”节确定的最佳浓度配制石榴花粗提物溶液50 mL，置于100 mL锥形瓶中，加入5 g预处理过的X-5大孔吸附树脂，25 ℃水浴吸附，分别在吸附后1、2、3、4、5、6 h取上清液样品2 mL，测定其多酚含量，绘制吸附动力学曲线。endprint

1.4.3.4 上样液流速对吸附效果的影响 将多酚含量为31 mg/mL的石榴花提取液50 mL（pH值由“1.4.3.1”节确定）分别以6、4、2、1 mL/min的流速上柱，然后用去离子水冲洗至澄清，以70%乙醇作洗脱液，流速2 mL/min，测定洗脱液中多酚含量，计算树脂对多酚的吸附量，然后以流速为横坐标、吸附量为纵坐标绘制曲线。

1.4.4 树脂洗脱条件的优化

1.4.4.1 乙醇浓度对洗脱效果的影响 取100 mL多酚含量为3 mg/mL的石榴花提取液，加入25 g X-5树脂，25 ℃下吸附12 h，湿法上柱，用去离子水冲洗，再分别用100 mL 20%、40%、60%、70%、80%的乙醇溶液洗脱，流速 6 mL/min，测定洗脱液中多酚含量，考察乙醇浓度对洗脱效果的影响。

1.4.4.2 洗脱液体积对洗脱效果的影响 依照“1.4.3”节优化的吸附条件上柱吸附之后，用40 mL水迅速冲洗树脂柱，洗脱条件：洗脱液由“1.4.4.1”节确定，流速为80 mL/h。洗脱液分步收集并测定其多酚含量，绘制动态解吸曲线，从而考察洗脱液体积影响洗脱液效果的情况。

1.4.4.3 洗脱流速对洗脱效果的影响 按“1.4.3”节优化的吸附条件上柱吸附之后，用40 mL水快速淋洗树脂柱，洗脱条件：洗脱液由“1.4.4.1”节确定，洗脱液体积由“1.4.4.2”节确定，洗脱流速分别为6、4、2、1 mL/min。收集洗脱液并测定其含量，考察洗脱流速对洗脱效果的影响。

2 结果与分析

2.1 树脂的的筛选

通过静态吸附与解吸试验测定5种大孔树脂的吸附与解吸特性，结果见表1。其中，X-5型大孔吸附树脂对石榴花多酚的吸附容量、吸附率、解吸率及回收率都是最高的。吸附量和解吸率是评价一种树脂性能优劣的主要参数，前者反映树脂的吸附能力，后者反映吸附之后能否容易洗脱下来。 因此，X-5树脂纯化石榴花中的多酚较为理想。

2.2 X-5大孔吸附树脂吸附条件的优化

2.2.1 上样液pH值对吸附效果的影响 由图1 可知，其他操作条件不变，随着pH 值的升高，树脂对石榴花多酚的吸附量逐渐降低，说明低pH值有利于吸附。石榴花多酚含有鞣花酸、没食子酸等酚酸类物质[2]，因此具有弱酸性，在pH值较大时会解离成离子形态存在，此时不易被大孔树脂吸附，而以分子态存在时易被所用的大孔树脂吸附。当pH值下降时，石榴花多酚多以分子态存在就易被大孔树脂吸附。因此，pH值为 2.0的条件最适合X-5树脂吸附石榴花多酚。

2.2.2 上样液浓度对吸附效果的影响 从图2可以看出，上样液浓度较低时，X-5树脂对对石榴花多酚的吸附量随上样液浓度的增大而增大；在石榴花多酚含量为3.1 mg/mL时，吸附量达到最大；之后，吸附量反而随上样液浓度的增大而逐渐下降，这种变化趋势与其他文献中的结果[13-15]一致。上样液的浓度决定了同一时间与树脂相互作用的目标物质分子数量，从理论上讲，在达到饱和之前，该数量越大越有利于目标物质的富集；超过一定值后，随浓度增大，吸附量下降，可能是由于上样液中的糖类等物质在较大浓度时黏度变大，堵塞树脂孔隙，目标物质与树脂相互作用的机会减少，从而影响对多酚的吸附量。因此，选择3.1 mg/mL作为上样液浓度。

2.2.3 吸附动力学曲线 吸附速度也是大孔树脂吸附性能的重要参考指标。25 ℃时，X-5树脂对石榴花多酚的静态吸附动力学曲线见图3。由图3可以看出，在0～5 h内，X-5树脂对石榴花多酚的吸附量随时间的延长而增大，之后趋于稳定，说明吸附 5 h即可达到饱和，而XDA-1树脂对杜仲黄酮的吸附需要10 h以上才能达到平衡[11]，可见X-5树脂对石榴花多酚的吸附属快速吸附平衡型。

2.2.4 上样液流速对吸附效果的影响 由图4可见，随上柱流速的增大，对石榴花多酚的吸附量逐渐减小。流速对树脂吸附的影响主要是影响溶质向树脂表面扩散，从而对吸附效果产生影响。上柱时流速过大，石榴花多酚溶液与树脂之间接触时间变短，石榴花多酚分子来不及进入到树脂的内表面而流过，从而降低吸附率。降低流速，会使石榴花多酚分子同树脂的内表面有足够的接触时间，有利于树脂吸附石榴花多酚，减少多酚的漏出量，从而提高其吸附率；当流速过小时，会使作业周期延长，提高成本。从本试验结果来看，上柱流速为1 mL/min的吸附量与上柱流速为2 mL/min的吸附量相差不大，因此上柱流速以 2 mL/min 为宜。

2.3 X-5树脂对多酚吸附后洗脱条件的优化

2.3.1 洗脱液浓度的选择 为尽可能提高多酚的回收率，通常选用解吸率较高的溶剂作为解吸剂，丙酮、甲醇及乙醇是常用的解吸剂，但考虑到石榴花多酚要应用在食品及化妆品中，因此本试验选用无毒性的乙醇作为解吸剂，并考察乙醇浓度对解吸效果的影响，结果如图5所示。当乙醇浓度为20%～60%时，解吸效果很低，变化也不大；超过60%之后，随乙醇浓度增大，解吸效果迅速提高，当乙醇浓度为70%时，解吸效果最好，之后又迅速下降。因此，宜选用70%乙醇溶液对石榴花多酚进行洗脱。

2.3.2 洗脱液体积对解吸效果的影响 经吸附达到饱和的X-5树脂先用40 mL的水洗去树脂吸附的可溶性糖类，再用200 mL的70%乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2 mL/min，在室温下测定乙醇溶液对多酚物质的动态洗脱效果，结果如图6所示。图6显示，在动态条件下极易洗脱X-5树脂上吸附的多酚物质，很少量的洗脱液即可达到洗脱效果。多酚物质的洗脱高峰也相对比较集中，当洗脱液体积为10～40 mL时，洗脱液中的石榴花多酚含量较高；在洗脱液体积达到80 mL时，能够将吸附在X-5树脂上的多酚充分洗脱，因此，洗脱液体积宜选择80 mL。

2.3.3 洗脱液流速对解吸效果的影响 图7显示，流速越大，洗脱效果越差，其中流速为1 mL/min 的解吸效果是流速为4 mL/min的3倍。因流速加快，洗脱液未能与被吸附的多酚进行充分作用而将其从大孔树脂的吸附位点上置换出来；而流速太小会使作业周期延长。因此，在本研究条件下，70%乙醇洗脱流速宜控制在2 mL/min。endprint

3 结论

X-5树脂用于石榴花多酚纯化具有吸附量大、吸附率高、易解吸等特点，是纯化石榴花多酚的理想材料。选用X-5大孔吸附树脂纯化石榴花多酚的最佳上样条件为：上样液浓度3.1 g/L，pH 值2.0， 上样液流速 2 mL/min； 最佳洗脱条件：洗

脱液为70%乙醇溶液，流速2 mL/min，洗脱液体积为 80 mL。

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