代其林　王金玲　马明莉　吕旭才　郭翠　王劲　杜世章

摘要：主要研究150 mmol/L NaCl胁迫处理对豇豆（Vigna unguiculata Linn.）幼苗叶片抗氧化酶活性的影响。结果表明，豇豆幼苗在受到NaCl胁迫后，其叶片内可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量随胁迫时间的延长均逐渐升高，胁迫12 h后，它们的含量都达到峰值；在150 mmol/L NaCl胁迫过程中，豇豆幼苗叶片的抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等活性在0～12 h期间逐渐上升，12 h后其活性也均达到最高值；在12～48 h胁迫期间，3种抗氧化酶活性逐渐下降，但仍强于非盐胁迫下的抗氧化酶活性。同时，对NaCl胁迫下这3种抗氧化酶基因的相对表达水平进行荧光定量分析，结果表明，SOD和CAT 等2种抗氧化酶基因相对转录表达水平与胁迫期间内相应酶的活性变化一致，而POD基因表达在胁迫6 h后就已经达到最大值，与其酶活性在12 h后达最大值是不一致的。分析结果表明，在盐胁迫下NaCl诱导了SOD、POD、CAT等 3种酶基因的表达，抗氧化酶活性相应增强，从而增强了豇豆幼苗应对NaCl胁迫的能力，为盐碱地培育豇豆作物具有一定指导意义。

关键词：NaCl胁迫；豇豆幼苗；抗氧化酶；可溶性蛋白；脯氨酸；丙二醛；实时定量PCR

中图分类号： S643.401 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0193-04

土壤盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题，是影响农业生产的主要环境因素。盐渍土壤能通过水分胁迫、盐分离子的生理毒害等作用对作物产生危害，因此能限制作物的生长、发育，甚至造成农作物的减产或绝收。当前，全球盐碱地面积已达9.5亿 hm2，中国有1亿 hm2[1]。中国的盐渍化土地主要分布在西北和华北地区，并有逐年扩大的趋势，而这些地区是我国主要的产粮地区，植物耐盐研究已经成为当今研究的热点。

在正常状态下，植物的光合作用和呼吸作用等代谢途径都会产生电子，电子在质膜上进行传递时会不断产生活性氧，这些活性氧包括超氧自由基（ O-2 · ）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）[2-7]。NaCl等盐非生物胁迫过程中所产生的低浓度活性氧可作为信号分子在植物的氧化还原反应中进行信号转导[8]，引起一系列的生理生化反应，并产生一定的生理抗性。而中度和重度非生物胁迫都会使植物体内产生过多的活性氧，使植物体内产生氧化胁迫[9-12]，甚至会严重破坏细胞的稳定性和正常的代谢，通常使脂质、蛋白质和核酸受到氧化损伤，从而造成细胞损伤，最终导致细胞死亡[5，13-15]。同时，NaCl等盐胁迫还会启动膜脂过氧化或膜脂脱脂作用，从而破坏膜结构，使质膜流动性增大，电解质渗出率增加，细胞内代谢毒物 （如丙二醛、MDA等）积累增多[8，16-18]。因此，活性氧参与了植物光合作用的调节、胁迫应答、病原反应、程序性细胞死亡、激素调节以及植物的生长发育等生理生化反应[5，19]。植物为了应对活性氧所引起的氧化胁迫，在进化过程中产生了一个有效的抗氧化防御系统[20]，这个防御系统主要由超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等组成，其中SOD能清除超氧离子，POD能清除过氧化物，二者产生的过氧化氢由CAT转化成氧气和水，从而解除活性氧对植物的毒害作用[15，19，21]。因此，抗氧化酶系统是植物应对氧化胁迫的一个重要反应机制[11，21- 22]。

豇豆（Vigna unguiculata Linn.）属于豆科豇豆属，是中国重要的蔬菜作物，在整个生长发育期对盐胁迫都很敏感。笔者发现，在0～250 mmol/L NaCl胁迫12 h后，豇豆幼苗叶片的可溶性蛋白质、脯氨酸、丙二醛含量以及抗氧化酶活性逐渐升高，在150 mmol/L时达到最大值[18]。本研究选取豇豆作为研究对象，考察150 mmol/L NaCl胁迫处理下豇豆幼苗叶片抗氧化酶活性的变化，测定丙二醛（MDA）、脯氨酸含量的变化，初步探索豇豆幼苗叶片3种抗氧化酶基因在NaCl胁迫下基因表达水平的变化，以期为今后豇豆在盐碱地栽培生产提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

豇豆品种为翠宝198豇豆。该品种抗病性强，特耐高温，具有分枝多、肉质脆嫩、爽甜、纤维少、不易老化等特点。

1.2 种子预处理

将豇豆种子用1% NaClO溶液浸泡10 min，流水冲洗3～5次后吸胀12 h，于25 ℃的光照培养箱中萌发24 h，再用蒸馏水清洗萌发的种子2～3次。将萌发一致的种子播种在已灭菌石英砂中，浇上MS营养液，置于人工培养室（25±1） ℃培养，每天补充水2次。待所有幼苗的第1对真叶全部展开时，选取长势一致的幼苗，分成2组：（1）对照组，（2）NaCl等盐胁迫试验组，每组重复3次。其中对照组直接用MS培养液浇灌，盐胁迫试验组都用含150 mmol/L NaCl的MS培养液对其进行盐胁迫处理。然后分别在处理后0、6、12、24、48 h后取样。每次取样均取豇豆的第1对真叶为试验材料，每次试验重复3次，取其平均值。

1.3 叶片酶粗液的提取

称取约0.5 g豇豆叶片组织于预冷的研钵中，加少量石英砂，2 mL （0.1 mol/L pH值6.8）的Tris-HCl缓冲液，在冰浴中研磨成匀浆，用2 mL缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液也转至离心管中，在4 ℃下，4 000 r/min离心20 min。将离心管的上清液分装于多个1.5 mL离心管中，储存于-80 ℃冰箱中。

1.4 分析与测定

可溶性蛋白质含量的测定按照Lowry法[23]，用牛血清蛋白溶液制作标准曲线；丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[24]；脯氨酸含量用茚三酮法[24]测定；用NBT光还原法测定超氧化物歧化酶的活性[25]；按Omran的方法测定过氧化物酶的活性[26]。而过氧化氢酶活性按Beers和Sizer的方法[27]进行。endprint

1.5 抗氧化酶基因的相对表达

用无DNA的RNA试剂盒（上海华瞬生物技术有限公司，W6711）提取豇豆幼苗叶片总RNA，然后把总RNA反转录合成第1链cDNA （reverse-transcription Kit，TaKaRa，Japan）。用IQ5 Real-time PCR仪（Bio-Rad）和根据Two-step QuantiTect SYBR Green PCR Kit试验指南对POD、SOD、CAT基因进行定量扩增，用iCycler定量分析软件（iCycler real-time detection system software，version 2.0）对基因的定量扩增数据。用Primer 12 Express 2.0 （Applied Biosystems）软件设计定量扩增引物（SOD、POD和CAT基因的引物分别为：POD F（5′-GGCATGTATTATGTTTCGTGCGTCTC-3′）和R（5′-GCGTCACAACCATTGACAAAGCAG-3′）；SOD F（5′-GTTCAACGGCGGAGGTCA-3′）和R（5′-AACATCAATACCCACCAGAGGA-3′）；CAT F（5′-GAAGGTTTCGGCGTCCACA-3′）和R（5′-TTGGTCACATCAAGCGGGTC-3′）；以及内参基因β-actin F（5′-ACTGTGCCAATCTACGAGGGTT-3′）和R（5′-TCTTACAATTTCCCGCTCTGCT-3′），其qRT-PCR产物长度为100～300 bp。用豇豆的β-actin管家基因来作为定量扩增的内参。所有的实时定量PCR扩增都重复3次。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫条件下豇豆幼苗叶片中总可溶性蛋白含量的变化

在NaCl等盐非生物胁迫条件下，可溶性蛋白参与了植物细胞渗透势的调节，较高质量分数的可溶性蛋白质，有利于植物细胞维持较低的渗透势，减少细胞内水分和溶质的流失[28]，从而减少盐胁迫带来的损坏。在150 mmol/L NaCl胁迫下，随着盐胁迫时间的延长，可溶性蛋白含量逐渐增加（图1），在胁迫12 h后，可溶性蛋白含量最高，为 819.812 μg/g，随后又逐渐下降。而对照组在0～48 h内可溶性蛋白质含量变化不大。

2.2 NaCl胁迫条件下豇豆幼苗叶片中丙二醛含量的变化

在逆境条件下，往往会发生膜脂过氧化作用，丙二醛是其产物之一，通常利用它来作为脂质过氧化的指标，表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱[29]）。豇豆幼苗在经150 mmol/L NaCl胁迫后，豇豆叶片的丙二醛含量一直升高。在胁迫12 h后，豇豆幼苗叶片丙二醛含量达最高，然后逐渐下降（图2）。表明在NaCl胁迫下，豇豆幼苗叶片通过提高丙二醛含量来抵御外界胁迫对膜脂流动和稳定性的影响。

2.3 NaCl胁迫条件下豇豆叶片中脯氨酸含量的变化

植物中游离脯氨酸具有较强的渗透调节能力及保护细胞膜结构稳定的作用，有助于维持低渗透压提高植物对水分的吸收[30]。在150 mmol/L NaCl胁迫下，豇豆幼苗叶片的脯氨酸含量逐渐上升，在胁迫12 h时达到最大值，然后逐渐下降（图3）。表明豇豆幼苗受到NaCl胁迫时，能够通过增加脯氨酸含量来提高细胞渗透势，从而提高豇豆抗性。

2.4 NaCl胁迫条件下豇豆叶片抗氧化酶活性的变化

在植物体内的抗氧化防御体系中，POD、SOD、CAT等酶系是最重要的保护酶类。在NaCl胁迫下，清除活性氧的抗氧化酶活性发生明显的变化，豇豆叶片中POD、SOD和CAT等酶系活性都不断增强（图4），在胁迫12 h后，活性均达到最大值，分别为61.475、28.965、125.863 U/（mg·min），然后又

逐渐减弱。说明在NaCl等盐胁迫过程中，植物体通过增强其抗氧化酶的活性来清除活性氧，避免逆境胁迫对自身的不利影响。

2.5 NaCl胁迫条件下豇豆叶片中抗氧化酶基因相对表达的变化

为了研究植物盐胁迫下的耐盐机制，用实时荧光定量PCR的方法研究3个抗氧化物酶基因在NaCl胁迫下的表达（图5）。在150 mmol/L NaCl 胁迫后，豇豆幼苗叶片POD、SOD、CAT基因的表达水平存在差异。其中，没有用盐处理的3种抗氧化酶基因有少量表达；在NaCl 胁迫后，豇豆幼苗叶片的POD、SOD、CAT等抗氧化酶基因的相对表达水平都有不同程度的增强，3个基因的表达水平都增加，其中SOD、CAT基因在 NaCl胁迫12 h后达到最大水平，与其酶活性的变化趋势一致，而POD基因在NaCl胁迫6 h后就达到最大表达水平，然后三者的表达量都开始下降。

3 结论与讨论

植物遭受NaCl等盐胁迫时，其体内的生理生化特性发生巨大变化。植物光合作用和呼吸作用所产生的过多电子在传递过程中，产生大量的活性氧[31-32]，过量活性氧对植物产生严重的氧化伤害，为了减轻或免于受到氧化伤害，植物启动了自身的防御系统，活性氧清除酶系统和非酶系统，其中SOD、POD、CAT是清除活性氧酶系统中最重要的种酶类。它们可以相互作用，降解活性氧种类，其中超氧化自由基被SOD催化发生歧化反应生成O2和H2O2，产生的H2O2再由POD、CAT分解[29]，从而减轻NaCl等非生物胁迫。本研究结果表明，在NaCl等盐胁迫下，豇豆幼苗叶片中3种抗氧化酶的活性与植物抗氧化胁迫能力相关，它们活性高低可作为衡量植物抗逆性强弱的重要指标。豇豆幼苗在受到NaCl胁迫时，其SOD、POD、CAT活性都增强，随着盐胁迫时间的延长，抗氧化酶均逐渐增加，三者酶活性12 h后最高，分别达到28.965、61.475、125.863 U/（mg·min）。尽管盐胁迫使SOD、POD、CAT活性都有所增强，但盐胁迫使细胞质膜处于氧化状态而受到损害，所以随着盐胁迫的进行，脯氨酸和MDA含量增加，质膜受损伤程度也逐渐加重。盐胁迫下豇豆幼苗叶片抗氧化物酶基因的表达都发生了变化，在没有NaCl处理时豇豆叶片POD、SOD、CAT基因都有微量表达，在150 mmol/L NaCl胁迫后，3种抗氧化酶基因表达都增加。POD基因表达量在胁迫6 h后就达到最高，而CAT和SOD的基因表达量在胁迫12 h后都达到最高，然后三者的基因表达均下降，与相应酶的活性变化基本一致，这与甘蓝型油菜在盐胁迫下基因表达与酶活性的变化情况[17]一致。表明这3个抗氧化酶基因都是诱导型表达的基因，在盐等逆境胁迫下，它们均可以过量表达。endprint

非酶活性氧清除系统也会发生巨大的作用，脯氨酸与可溶性蛋白是植物体内普遍存在的物质，在逆境条件下，二者通过参与体内的某种代谢活动对植物进行保护性的调节，以增强抗逆性[31]。在NaCl等盐胁迫下，脯氨酸的积累是植物体抵御渗透胁迫的有效方式之一。脯氨酸含量的增加能够降低叶片细胞的渗透势，防止细胞脱水；而且脯氨酸具有很高的水溶性，可以保护细胞膜系统，维持细胞内酶的结构，减少细胞内蛋白质的降解。大量研究表明，许多植物在盐胁迫下脯氨酸迅速积累，耐盐植物中的脯氨酸含量高于不耐盐植物[29，31]。MDA是膜脂过氧化作用的最终产物，其含量的高低是膜脂过氧化程度的重要标志[31]。

本研究结果显示，盐胁迫可诱导豇豆叶片中抗氧化酶活性的增强，这些酶有可能协同作用共同抵抗盐胁迫造成的氧化伤害，但这种诱导作用并非是无限的，重度胁迫可能对植物造成不可逆的伤害。由此推测，严重盐胁迫对豇豆造成了一种不可逆的伤害，但相关机制还有待于进一步研究证实。

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