吴文嫱+韦永选+周鑫+黄小龙+许云+黄东益

摘要：炭疽病是大薯生产上最严重的病害，迫切需要可靠的方法来筛选抗病种质。采用薯蓣上分离到的2份炭疽病菌株SY01、DJ01的分生孢子对大薯Da87、Da115的组培苗进行接种，通过对病情指数的比较分析最佳的接种方法。结果表明：大薯Da87、Da115对炭疽菌的抗性差异极显著，菌株SY01、DJ01之间致病力差异极显著；在筛选的接种方法中，最佳的为使用3×106个/mL孢子浓度的涂抹法。

关键词：大薯；炭疽病；接种方法；病情指数；抗病评价

中图分类号：S436.32 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）10-0174-02

薯蓣家族广泛种植于热带和亚热带地区，大薯被公认为是薯蓣中分布最广、最多的种[1]。大薯（Dioscorea alata）别称参薯、脚板薯、菜山药，为薯蓣属单子叶藤本植物，在我国长江以南地区均有种植，是四大薯类作物中营养最丰富的作物，在非洲一些国家是仅次于木薯的主粮。

炭疽病发病可从苗期开始一直到采收，严重影响大薯的生长及薯块的产量。来自加勒比、南太平洋、西非和印度等国家和地区的统计结果表明，该病严重时导致产量下降90%，几种常见的栽培种都缺乏抗性[2-3]。炭疽病（胶孢炭疽菌）引起叶片坏疽并且藤蔓枯萎，导致光合作用表面积的下降并且伴随着薯蓣块茎产量的下降。在块茎形成前或者是形成期间病害的流行对块茎产量的影响是极大的。炭疽病可发生在全株，包括叶片、藤蔓、薯块，带病的种薯、土壤会持续影响，甚至导致绝种[4]。在我国南方地区，高温多雨的天气更有利于大薯炭疽病的发生和发展。在法国西部和尼日利亚侵染薯蓣类作物的炭疽病病原菌表现出遗传性和致病性的明显差异[5-8]。国内外大多采用离体叶片进行抗性鉴定，笔者经过多年研究发现该法并未能完全反映种质的抗性水平且重复性比较差。由于大薯在种植时主要采用薯块育苗，进行苗期抗性鉴定需要大量的薯块，且生产周期上无法满足准确可靠的抗病性鉴定的试验要求。用组培苗进行大量基因型的快速筛选对于胶孢炭疽菌的毒力和侵染力的分析是精确有用的[9]，组培苗还可用于栽培种-分离物互作的研究和研究侵染进程[10-11]。更进一步，组培苗可用于评价栽培种对特定分离物的反应。这些对于非当地的胶孢炭疽菌的筛选和国家交流项目的薯蓣评价是可行的[12]。因此，本研究欲采用已分离鉴定的炭疽病菌对大薯组培苗进行抗性鉴定，筛选最佳的接种方法。目前，笔者所在课题组已经收集了我国南方地区160份的大薯种质资源，建立了我国的薯蓣种质资源圃，分离鉴定了100株来自薯蓣的炭疽病菌株，建立快速有效的苗期抗性鉴定方法对于我国大薯抗性种质资源的筛选十分必要。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：DJ01（分离自海南儋州大薯）、SY01（分离自海南海口山药）；供试大薯：Da87、Da115；盆栽基质：营养土 ∶ 陶粒 ∶ 草木灰=3 ∶ 1 ∶ 1。

1.2 试验方法

1.2.1 大薯组培苗的获得 以幼嫩的大薯实生苗的单个带节茎段为外植体，经自来水冲洗30 min，用75%乙醇浸泡15 s，选用0.1%HgCl2处理8～10 min，再用无菌水洗3～5次。将消毒好的带芽茎段接种到培养基（MS+3%蔗糖+03%植物凝胶，pH值5.8）中。无菌苗培养2个月，选择长出5～8张叶且已生根的材料进行炼苗。炼苗1周后移栽至营养钵，待植株叶片开始恢复生长后进行接种。

1.2.2 接种菌孢子的制备 先将菌种接在PDA 平板上进行活化，在28 ℃下培养7 d，经过过滤纯化后收集孢子配置悬浮液。采用血球计数板计数法将供试菌株的孢子悬浮液分别配制成3个浓度：3×105、 3×106、3×107个/mL。

1.2.3 接种方法 接种采用喷雾法、多针接种法、涂抹法进行试验。采用2种菌株接种2种大薯种质，分别用上述3种浓度处理，每个处理10株苗，设置3株接种水作为对照，试验重复3次。接种时室温为（26±2） ℃，用塑料薄膜覆盖，黑暗保湿2 d，之后揭开覆盖，自然光照下培育。接种12 d后开始调查发病情况及统计病情指数。

1.2.4 病叶分级 大薯炭疽病室内苗期抗病性调查分级标准：0级，无症状；1级，病斑直径0～1.0 mm，有1～2张叶发病；2级，病斑直径在11～20 mm，有2张真叶发病，或有少数大斑；3级，病斑直径在21～30 mm，并产生孢子，或有2张以上叶片发病，病株出现落叶，株形不正常；4级，有许多大斑，大量产生孢子，病株大量落叶，近枯死或枯死。

（1）病情指数。将参试品种的发病级别按病情指数计算式换算成该种质的病情指数，换算公式如下：病情指数（DI）=∑（株数×病级数）/（总株数×最高病级数）×100。

（2）抗病性评价标准。薯蓣种质炭疽病抗性鉴定分为6个等级[13]：1级，免疫（immune，I），DI=0；2级，高抗（highly resistant，HR），080。

1.2.5 菌株致病性分级 菌株致病性类型划分标准如下[14]：强（A）：平均病情指数40.1～ 100.0；中（B）：平均病情指数 20.1～ 40.0；弱（C）：平均病情指数0.1～20.0；无致病力（D）：平均病情指数为0。

1.2.6 数据分析 数据采用SAS软件进行Duncanss测验。

2 结果与分析

2.1 大薯种质的炭疽病抗性鉴定

不同处理下大薯种质的病情指数均值（表1）表明：大薯种质Da115、Da87对炭疽病的抗性为中感（MS），Da115、Da87的病情指数差异极显著，Da115较Da87更易感病。

2.2 薯蓣炭疽菌菌株的致病力检测

由表2不同处理下薯蓣炭疽菌菌株致病后引起的病情指数均值表明：薯蓣炭疽菌菌株DJ01、SY01的致病性为中致病性，二者的致病力差异极显著，菌株DJ01的致病力较强。

2.3 不同接种菌液孢子浓度和不同接种方法对大薯炭疽病发病情况的影响

表3的2份炭疽菌菌株的3种孢子浓度接种2份大薯种质后的病情指数的统计结果表明：多针接种法和涂抹法的不同孢子浓度接种后病情指数差异均达到了极显著水平；喷雾法的孢子浓度水平为 3×105、3×106个/mL之间差异未达到极显著水平。当孢子浓度水平为3×105个/mL时，涂抹法和喷雾法的病情指数较低，且差异不显著，未达到大薯种质病情指数的均值，不适于进行抗病性鉴定。当孢子浓度水平为3×106、3×107个/mL时，3种接种方法的病情指数差异均达到了极显著水平。综合来看，多针接种法发病早，病情指数均高于2份大薯种质的平均病情指数和2份炭疽菌菌株的平均致病力，当孢子浓度水平为3×107个/mL时病情指数均值高达90.26，接近死亡，因此多针接种法不适合用于大薯种质的抗病性鉴定。喷雾法总体的病情指数较低，需要较高的孢子浓度才能达到适合的病情指数。当孢子浓度为3×106个/mL时，涂抹法的病情指数与大薯种质的平均病情指数和炭疽菌平均致病力较一致。因此最佳的接种方法为涂抹法，孢子浓度水平为3×106个/mL。

3 结论与讨论

目前，活体接种的结果能较充分地反映植株对病原菌的抗性，室内接种鉴定方法的研究能为抗性种质筛选提供可靠的依据。Onyeka等用3份大薯炭疽菌分离物（胶孢炭疽菌）来评价60份大薯栽培种的组培苗反应，认为组培苗提供了用于评价大量大薯种质的快速、可靠和健全的方法，可进一步用于田间的测试，这项技术降低了大量株系所需要的大面积土地[12]。Akem用喷雾法接种大薯抗病种质Dan087、TDa86/00620、TDa316以及感病种质TDa85/00257、TDa86/00607、TDa85/00250进行致病性试验，每个植株用2mL孢子浓度为1.6×106个/mL的孢子悬浮液喷雾接种，28 d后观察并记录植株的感病情况[15]。炭疽病菌孢子虽然是接种在活体植株上，但是发病周期较长。陈吉良采用大薯和山药的离体叶片进行菌株致病性鉴定和植株的抗性初筛，初筛结果往往与田间的抗性鉴定不一致，这可能与田间环境有较大差异相关，也可能是离体叶片与活体植株的差异导致的[16]。本试验中对于同一份材料的抗病等级是基于不同处理下病情指数的均值，在3种接种方法中基于这个均值进行衡量，多针接种法发病快、发病较严重，但是较难比较种质之间的抗性差异；喷雾法发病较慢，需要较多的孢子进行侵染；相比之下，涂抹法较适中。在3种孢子浓度侵染时，孢子浓度为3×105个/mL时，仅在多针接种法中表现出较高的病情指数，而在涂抹法和喷雾法中均表现为较低的病情指数；浓度为3×106个/mL时，多针接种法有较高的病情指数，而喷雾法有较低的病情指数，涂抹法较适宜；浓度为3×107个/mL时，多针接种法接种的植株接近死亡，适宜用涂抹法和喷雾法。因此，本研究表明，当孢子浓度水平为3×106个/mL时，涂抹法最适宜大薯组培苗的抗病性鉴定。

参考文献：

[1]Anon. Annual report of project 13：Improvement of yam-based systems[R]. Ibadan，Nigena：IITA，1998.

[2]Winch J E，Newhook F J，Jackson G V H，et al. Studies of Colletotrichum gloeosporioides disease on yam，Dioscorea alata，in the Solomon Islands[J]. Plant Pathology ，1984，33（4）：467-477.

[3]McDonald F D，Alleyne A T，Ogarro L W，et al.Yam anthracnose in the English-speaking islands of the Eastern Caribbean-successes and research advances in disease management[J]. Tropical Agriculture，1998 75：53-57.

[4]Kutama A S，Auyo M I，Binta S B，et al. Combating yam anthracnose in Nigeria：a review[J]. Standard Research Journal of Agricultural Science，2013，1（3）：21-26.

[5]Abang M M，Hoffmann P，Winter S，et al. Vegetative compatibility among isolates of Colletotrichum gloeosporioides from yam（Dioscorea spp.） in Nigeria[J]. Journal of Phytopathology，2004，152（1）：21-27.

[6]Abang M M，Fagbola O，Smalla K，et al. Two genetically distinct populations of Colletotrichum gloeosporioides Penz.causing anthracnose disease of yam（Dioscorea spp.）[J]. Journal of Phytopathology，2005，153（3）：137-142.endprint

[7]Frézal L，Jacqua G，Neema C. Etude de la diversite genetique de Colletotrichum gloeosporioides，agent causal de lanthracnose de ligname blanche en Guadeloupe.[C]//Tours，France：Proceedings of the 7th International Conference on Plant Diseases，2003.

[8]Frézal L. Etude de la diversité génétique de Colletotrichum gloeosporioides，responsable de Ianthracnosse de Iigname alata （Dioscorea alata） en Guadeloupe[D]. Paris，France：Université de Paris-Sud，2005.

[9]Abang M M，Green K R，Wanyera N W，et al.Characterization of Colletotrichum gloeosporioides Penz. from yam （Dioscorea spp.） in Nigeria[C]. Ibadan，Nigeria：I Proceedings of the 7th Triennial Symposium of the International Society for Tropical Root Crops，African Branch，1998：613-615.

[10]Green K R，Abang M M，Iloba C. A rapid bioassay for screening yam germplasm for response to anthracnose[J]. Tropical Science ，2000，40：132-138.

[11]Onyeka T J，Petro D，Etienne S，et al. Optimizing controlled environment assessment of levels of resistance to yam anthracnose disease using tissue culture-derived whole plants[J]. Journal of Phytopathology，2006，154（5）：286-292.

[12]Onyeka T J，Pétro D， Ano G，et al.Resistance in water yam（Dioscorea alata） cultivars in the french west indies to anthracnose disease based on tissue culture-derived whole-plant assay[J]. Plant Pathology，2006，55（5）：671-678.

[13]王 智. 山药种质资源抗性鉴定、抗病机制研究和遗传多样性分析[D]. 郑州：河南农业大学，2004.

[14]李 越，刘云龙，李 凡，等. 非洲菊根腐病品种抗病性鉴定及病原菌的致病性分化[J]. 云南农业大学学报，2008，23（1）：33-35，41.

[15]Akem C N. Yam die-back and its principal cause in the yam belt of Nigeria[J]. Pakistan Journal of Biological Science，1999，2（4）：1106-1109.

[16]陈吉良. 薯蓣炭疽病病原菌分离鉴定及抑菌制剂的筛选[D]. 海口：海南大学，2011. 柴 虹，潘海珠，胡 浩. 酪酸梭菌与粪肠球菌的混合培养[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：279-280.endprint