杨洋　胡永红　杨文革　曹峥　张棋

摘要：以多抗菌素生产菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382为试验菌株，在单因素试验的基础上进行Plackett-Burman试验和中心组合试验设计，采用响应面法建立发酵培养基的优化模型，得到最优产多抗菌素的培养基：蔗糖17.42 g/L，酵母膏18.72 g/L，KH2PO4 0.69 g/L，FeSO4 0.2 g/L，CaCO3 0.3 g/L。经试验验证，在此条件下，多抗菌素的效价可达2 300 μg/mL，比优化前提高了40%。

关键词：多抗菌素；培养基优化；响应面法；条件；效价

中图分类号： S482.2+8 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）10-0154-04

目前，植物病害在全球范围内每年造成高达数千亿美元的损失，而其中又以真菌病害最为严重。多抗菌素（polyoxins）也被称为多效霉素，多抗霉素，多氧霉素，是一种抗真菌核苷类抗生素。多抗菌素能够抑制真菌细胞壁几丁质的合成，被广泛应用于治疗水稻纹枯病、梨黑斑病和番茄灰霉病等植物真菌病害，是一种有效防治植物真菌病害的生物农药[1-2]。多抗菌素作为一种广谱性抗生素，具有良好的内吸性和高度的靶标生物选择性，已成为国内外杀菌、除虫的一线药物之一[3-4]。然而，在多抗菌素发酵生产过程中，多抗菌素效价低、生产成本高、发酵周期长等问题限制了其推广应用[5-7]。因此，对多抗菌素发酵培养基优化及条件初探具有重大意义。本研究以多抗菌素生产菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382为试验菌株，应用响应面法系统考察了影响多抗菌素效价的培养基成分，得到最佳培养基配方，从而提高多抗菌素的产量。

1 材料与方法

1.1 菌种

多抗菌素产生菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382，由课题组保藏。

1.2 培养基

斜面培养基：马铃薯200 g/L，蔗糖：20 g/L，琼脂15～20 g/L，自然pH值；种子培养基：蔗糖10 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，FeSO4 0.2 g/L，CaCO3 0.3 g/L，pH值6.0；发酵培养基蔗糖20 g/L，酵母膏20 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，FeSO4 0.2 g/L，CaCO3 0.3 g/L，pH值6.0。

1.3 主要试剂和仪器

试验主要试剂：蔗糖、葡萄糖、甘油、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母膏、琼脂粉（国药集团化学试剂有限公司），FeSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4·3H2O、NaNO3、CuSO4、CaCO3（广东汕头市西陇化工厂）。

试验仪器设备：电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、灭菌锅（华粤行仪器有限公司）、医用净化工作台（苏州净化设备厂）、鼓风电热恒温干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）、基础分析型纯水机（青岛富勒姆科技有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 多抗菌素含量的测定 用管碟法测量发酵液中多抗菌素的含量。使用水稻纹枯菌为指示菌种，配制不同浓度的多抗菌素标品，牛津杯装液量为200 μL，置于28 ℃培养箱中培养48 h。根据不同浓度标品和抑菌圈的大小，绘制标准曲线。

1.4.2 单因素试验设计 分别对氮源、碳源、无机盐进行优化，配制发酵培养基，28 ℃发酵培养5 d，测定每种因素对多抗菌素含量的影响，选择最佳培养基成分。

1.4.3 响应面试验设计

1.4.3.1 Plackett-Burman（PB）设计试验 采用PB试验从多个单因素中筛选出对多抗菌素发酵影响最显著的几个因素，使用Design Expert软件设计试验方案，包括11个变量（n=11），其中8个主要因素（蔗糖、麦芽糖、肌醇、蛋白胨、酵母膏、FeSO4、KH2PO4、CaCO3）和3个虚拟变量（表1），11个变量分别用A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K来代表，每个变量有高（+）和低（-）2个水平，设置高（+）水平是低（-）水平的1.5倍，共进行12组试验（表2）。

1.4.3.2 最陡爬坡试验 在PB试验中得到了影响较为显著的3个因素，并且根据PB设计得出的一次项拟合方程中相应变量的系数，从而确定变化梯度和爬坡方向。若变量系数为负，则该变量水平以梯度递减的方向进行爬坡试验。若变量系数为正，则该变量水平以梯度递增的方向进行爬坡试验，这样就能够经济、快速地逼近最佳区域。将最陡爬坡试验中得到的多抗菌素发酵产量最高点作为中心组合设计的的中心点来设计试验方案。

1.4.3.3 响应面分析法 经过最陡爬坡试验，逼近多抗菌素最大化生产区域，根据中心组合设计（central composite design）原理，对经过PB和爬坡试验的变量进行5水平试验（-α、-1、0、+1、+α），共20组，使用Design-Expert软件对试验结果进行分析，研究多抗菌素的最优发酵培养基配方。

2 结果与分析

2.1 多抗菌素含量的测定

配制不同浓度的多抗菌素标样，使用管碟法（牛津杯法）测定不同浓度多抗菌素标准品的抑菌圈大小，以抑菌圈直径（mm）为横坐标、多抗菌素浓度（μg/mL）为纵坐标绘制标准曲线，见图1。多抗菌素浓度在200～2 400 μg/mL范围内线性拟合度良好，其回归方程为y=138.23x-2 058.46，x代表抑菌圈直径，y代表多抗菌素浓度。相关系数r=0.998，说明该方程具有良好的相关性，可以用于多抗菌素含量的测定。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 氮源对多抗菌素发酵的影响 氮源在合成菌体蛋白质、核酸、酶及各种初级和次级代谢产物等含氮物质的过程中发挥着重要的作用，同时在发酵生产中氮源还起着调节菌体的生长及生物量的作用。由图2可知，有机氮源比无机氮源对多抗菌素发酵的促进作用更为显著，在添加有机氮源的培养基中，菌体生长良好，产物正常生成；而在添加无机氮源的发酵培养基中，菌体生长较稀疏，并且无法产生多抗菌素，这可能是因为该链霉菌无法利用无机氮源来生产多抗菌素。在有机氮源中，酵母膏效果最好，蛋白胨次之。endprint

2.2.2 碳源对多抗菌素发酵的影响 碳源是构成菌体的基本骨架，是菌体生长的能量来源，是各种代谢产物的重要来源，通过影响菌体的呼吸、能量、生长及相关代谢最终影响抗

生素等次级代谢产物的产量。由图3可知，在供试的8种碳源中蔗糖、麦芽糖和肌醇对多抗菌素发酵效果较为理想，其中蔗糖效果最好。其他5种碳源对多抗菌素生成的效果相对较差，该链霉菌对其他5种碳源利用率不高。

2.2.3 无机盐对多抗菌素发酵的影响 在微生物生命活动中，无机盐构成菌体组成成分，作为酶的组成部分，酶的激活剂或是抑制剂，调节培养基渗透压、pH值及氧化还原电位等。由图4可知，添加KH2PO4多抗菌发酵效果最好，FeSO4和CaCO3次之。因此在下个阶段的PB设计中，将KH2PO4、FeSO4 和CaCO3作为考察因素，其用量分别为0.2、0.5、1 g/L。

2.3 响应面试验设计

2.3.1 Plackett-Burman（PB）试验 对多抗菌素发酵影响较大的8个主要因素，再加3个虚拟变量（表1）。每个变量有高（+）、低（-）2水平，共计12次试验结果见表2。使用Design-Expert软件对表2进行分析，结果见表3。由表3可知，上述8个因素对发酵生产多抗菌素的显著性由大到小的顺序为蔗糖、酵母膏、KH2PO4、麦芽糖、蛋白胨、肌醇、CaCO3、FeSO4，其中蔗糖为极显著因素。该模型R2=0.975 9，表示该模型可以解释97.59%的发酵产多抗菌素水平的变化。P值小于0.05表示该因素为显著因素，从8个因素中选出对多抗菌素发酵生产影响显著的因素（蔗糖、酵母膏、KH2PO4）进行下一步试验优化。

2.3.2 最陡爬坡试验 根据PB试验设计结果，蔗糖、酵母膏、KH2PO4的模型方程系数为正值，其浓度水平应增加，根据3个因素的效应值大小设计它们的变化方向及步长进行最陡爬坡试验，试验设计结果见表4。由表4可知，选择第5组试验方案时，即蔗糖20 g/L、酵母膏20 g/L、KH2PO4 0.7 g/L，对应的多抗菌素发酵液效价达到最高值，以此值为中心值进行响应面试验，这样响应面方程更能充分地逼近真实值。

2.3.3 响应面分析法 经过Plackett-Burman试验和爬坡试验，确定蔗糖、酵母膏、KH2PO4的水平，利用Design-Expert 软件设计响应面试验（表5）。根据表6结果，使用Design-Expert软件进行拟合，得到三元二次回归方程y=2 021.98-160.49x1-55.76x2-77.29x3+6650x1x2-16.00x1x3+7.75x2x3-170.21x12-177.28x22-237.91x32，其中：y为多抗菌素效价，x1、x2、x3分别为蔗糖、酵母膏、KH2PO4浓度。

2.4 响应面优化结果的分析

由二元回归方程所得到的的响应面图与相应的等高线图见图5至图7。各因素交互作用对响应值多抗菌素产量的影响由图可以直观地反应出来[8-10]

图5表明，在KH2PO4一定的情况下，蔗糖和酵母膏的交互作用显著，随着蔗糖和酵母膏含量的增加，多抗菌素效价不断提高，后期呈现小幅下降。

由图6可知，在酵母膏一定的情况下，随着蔗糖和KH2PO4含量的增加，多抗菌素效价不断提高，后期呈现下降趋势。在一定程度上，提高培养基中蔗糖和KH2PO4的含量有利于提高多抗菌素效价，但蔗糖浓度过高会影响细胞通透性，抑制菌体生长，不利于多抗菌素产量的增加。

由图7可知，在蔗糖一定的情况下，酵母膏和KH2PO4交互作用较显著，随着酵母膏和KH2PO4含量的增加，多抗菌素效价不断提高，但酵母膏对多抗菌素效价的影响大于KH2PO4对产量的影响。

为了能够求出培养基的最佳配方，对回归方程中各个变量求一阶偏导数，解得：x1=17.42，x2=18.72，x3=0.69，此时多抗菌素效价为2 076 μg/mL。并进行试验验证，在最适发酵条件下，重复3次试验，多抗菌素效价实测值2 300 μg/mL，与预测值基本符合，说明响应面法对多抗菌素发酵培养基优化具有较强可靠性。因此，我们得到最佳培养基配方是：蔗糖17.42 g/L，酵母膏18.72 g/L，KH2PO4 0.69 g/L。

3 结论

在单因素试验的基础上，经Plackett-Burman试验确定

了蔗糖，酵母膏，KH2PO4为主要影响因素，在此基础上，进行最陡爬坡试验，确定最佳响应面区域，然后采用中心组合试验设计和Design Expert 软件分析计算，得到这3种因素的添加量：蔗糖17.42 g/L，酵母膏18.72 g/L，KH2PO4 0.69 g/L。经过验证在此发酵条件下多抗菌素效价达2 300 μg/mL。然而，此研究仅限于摇瓶发酵， 很多因素（如溶氧，通气量等）难以有效控制，下一步可以上罐分批发酵，进一步优化验证影响多抗菌素发酵的条件。

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