吕书阳 李树学(赤峰艾克制药科技股份有限公司，内蒙古 赤峰 024000)

灰黄霉素(griseofulvin)，属于芳香族衍生物类抗生素，分子式为C17H17ClO6，相对分子质量为352.77。生物合成灰黄霉素过程中，缺少氯离子或氯化反应受阻时，灰黄霉素的合成量下降甚至不能产生，会通过一个分支反应途径，形成去氯灰黄霉素。去氯灰黄霉素抗真菌的活性很弱，会严重影响灰黄霉素的使用效果，是灰黄霉素发酵产物中的主要杂质，所以必须严格控制灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素的含量。而在质量控制和检验过程中，需要去氯灰黄霉素的纯品作为对照标准品。本文探讨了从灰黄霉素中提取和分离去氯灰黄霉素的条件和方法。

1 材料与方法

1.1 实验药品及来源:灰黄霉素产品:由赤峰制药股份有限公司提供；试剂为分析纯，设备仪器为实验室常规使用设备。

1.2 实验方法

1.2.1 薄层层析法考察洗脱剂的条件:通过HPLC法测得灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素的含量为0.3%。根据相关文献可知，去氯灰黄霉素在丙酮和N，N-二甲基甲酰胺中具有较大的溶解度，故分离去氯灰黄霉素的展开剂由乙酸乙酯与正己烷组成。本实验以不同配比的展开剂进行薄层层析对比分离效果，并对比采用丙酮和N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂的分离效果。

1.2.2 硅胶柱层析

a准备工作:取一柱长45cm，直径约3cm的下端有沙漏和活塞的玻璃层析柱，洗净，凉干。取层析硅胶200克于大烧杯中，加入配好的比例为正己烷:乙酸乙酯为1:3的展开剂至层析硅胶完全浸没，密封，放置24小时。

b装柱:向浸泡后的层析硅胶中加入适量展开剂，用玻璃棒搅起硅胶沉淀，然后将浑浊夜倒入玻璃柱中然后静止，待硅胶沉淀完全，放出适量展开剂，再以同样的方法将剩下的层析硅胶装入柱内，静置至沉淀完全，始终保持液面高于层析硅胶上面。

c样品溶液配制:称取约30g的灰黄霉素产品于100mL锥形瓶中，加入展开剂至100mL的刻度线处，置于超声波仪器中超声30min，取出静置至沉淀完全，将上清液用滤纸过滤后收集滤液，待用。

d层析分离:将过滤后的样品溶液加入到层析柱中，加入样品溶液的高度约4cm，流速每秒1-2滴，用50mL锥形瓶接流出液，做薄层层析，收集带有去氯灰黄霉素斑点的流出液。

经过柱层析，灰黄霉素和去氯灰黄霉素并未成功分离，可能是溶剂丙酮影响了展开剂的比例，使层析效果不佳。改为N，N二甲基甲酰胺溶剂后，分离效果理想。去氯灰黄霉素在灰黄霉素产品中含量很少，须经多次硅胶柱层析，将所有收集到的去氯灰黄霉素溶液合并，进行浓缩结晶，才能得到一定量的去氯灰黄霉素溶液。

1.2.3 浓缩与结晶:将含有去氯灰黄霉素组分的合并洗脱液用旋转蒸发仪进行浓缩，60℃条件下蒸馏，将得到的剩余溶液倒入干净的锥形瓶中，加入少量水，即有白色晶体析出，经过滤、洗涤、干燥，即得去氯灰黄霉素结晶。

1.2.4 产物的纯度检查:采用反向HPLC法，以乙腈:水=35:65为溶剂，以乙腈:水:冰乙酸=40:50:1为流动相。采用面积归一化法计算产品的纯度，在相同条件下测定去氯灰黄霉素和灰黄霉素产品的色谱图。

2 结果

2.1 薄层层析法考察洗脱剂的条件

2.1.1 丙酮作为溶剂时薄层层析法结果:各比例展开剂的薄层层析实验图如图1，其中1为去氯灰黄霉素，2为灰黄霉素。其中展开剂正己烷:乙酸乙酯的比例分别为:a=1:1，b=1:2，c=1:3，d=2:1，e=3:1。由图可知，样品中物质分离且样品点展开位置比较理想的是正己烷:乙酸乙酯为1:3的展开剂。

2.1.2 N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂时薄层层析法结果:不同溶剂所得薄层色谱图效果如图2。其中1为去氯灰黄霉素，2为灰黄霉素。f是以N，N二甲基甲酰胺为溶剂，g是以丙酮为溶剂。对比可知，以N，N二甲基甲酰胺为溶剂时，样品中物质分离较好，且样品点展开位置比较理想。

图1 、同配比展开剂所得薄层色谱图

图2 、不同溶剂所得薄层色谱图

2.2 硅胶柱层析结果

采用HPLC面积归一化法计算去氯灰黄霉素的纯度为90.5%，保留时间为10.640，谱图见图3。在相同条件下测定灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素的保留时间为10.429，谱图见图4。

图3 去氯灰黄霉素溶液HPLC图谱

图4 灰黄霉素产品溶液HPLC图谱

3 结语

通过实验分析可知，在展开剂中正己烷:乙酸乙酯为1:3时，灰黄霉素和去氯灰黄霉素有较好的分离效果，因此选择正己烷:乙酸乙酯(1:3)的展开剂为柱层析的洗脱剂，以N，N二甲基甲酰胺为溶剂，分离得到的去氯灰黄霉素，其HPLC主峰保留时间(t=10.640min)与灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素峰的保留时间(t=10.429min)基本一致，说明所得产物为去氯灰黄霉素，且纯度可达90.5%。

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