周 田，戴林建，杨 苏，陈 武，邓 杰 (湖南农业大学农学院，湖南长沙410128)

烟草花药培养是指改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，产生再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株的一个过程［1］。钾高效烤烟杂交品种是经多年试种而形成的富钾烟叶品种，但经多年的观察种植发现其常年发病，范围广，程度深。为寻求抗病优质烤烟，花药培养在国际上取得巨大进步，从第1次毛蔓陀罗花药培养取得的成功开始［2］，很多国家相继进行了花药培养方面的研究工作，使该技术在育种工作中不断走向成熟，其可迅速获得纯合型材料，获得育种中间材料，缩短育种年限，大大加快了育种速度，节省了大量的人力、物力。除此之外，还可作为遗传工程受体［3］。鉴于此，笔者以3个钾高效烤烟杂交品种为试验材料进行了花药培养，以期为实现既富含钾又具稳定抗病性的优势烟叶提供借鉴。

1 材料与方法

1．1 材料 云87×GK3、K326×GK3、G80×GK5品种均由中南烟草试验站提供。

1．2 方法

1．2．1 花药预处理。晴天在田间采摘花粉正处单核靠边期(花萼与花冠等长)的花蕊，放入5～7℃冰箱内低温预处理，处理时间为1～3 d。

1．2．2 花药消毒。取适量花蕊在一定大小容器中用无菌水冲洗2次，再用75%乙醇漂洗30 s，接着无菌水冲洗2次，而后用20%次氯酸钠灭菌15 min，过后无菌水冲洗4次，置于无菌滤纸上除湿。

1．2．3 培养基制备。试验直接采用市场上人工合成的MS培养基，具体为1/2MS+20 g蔗糖+1 000 ml水+7 g琼脂，灭菌冷却至50℃左右后加入激素0．80 g/L 6-BA和0．16 g/L IAA，pH 5．8。生根培养基无需加激素类，将蔗糖量调为30 g和pH调为6．0即可。

1．2．4 花药接种与培养。在25℃、每天光照12 h的培养条件下剥取消毒过的花药置于培养基中，观察记录各时期花药特征。待花药萌发出苗后，计算出苗率并将其进行分株，明确烟苗株数。

2 结果与分析

2．1 不同烟草杂交品种花药培养诱导频率差异 用1/2MS的培养基进行不同烟草杂交品种的花药培养，试验共接种3个品种，分别是云87×GK3、K326×GK3、G80×GK5，均为高钾杂交种，所有品种均培养出苗，但花药萌发率却存在差异。由表1可知，云87×GK3的萌发率最高，K326×GK3次之，G80×GK5最低。云87×GK3的花药萌发率为9．6%，接近于K326×GK3的花药萌发率(9．1%)，而G80×GK5的萌发率却只有4．0%，与前两者存在较大差异。这可能与杂交品种的不同有关，前2个杂交品种均是与GK3杂交，而后者是与GK5杂交，且杂交原种也各不相同，这可能是导致各品种萌发率不同以及前两者与后者萌发率相差大的原因。

表1 不同烟草杂交品种花药培养诱导率差异

2．2 不同烟草杂交品种的单个花药培养成苗株数差异 供试的3个高钾杂交品种均处在相同培养基、同一温度等条件下诱导培养，所有萌发的花药均由愈伤组织或胚状体发育成正常烟苗，但单个花药的出苗株数却各不相同。由表2可知，云87×GK3的已萌发的花药中，平均每个花药可长出6株左右烟苗，而 K326×GK3和G80×GK5却只有2．38和2．00株，明显低于云87×GK3。究其原因，可能是因为品种基因型不同，品种不同，花药中的花粉的抗逆性就有强有弱，由胚状体长成植株的数目也就有多有少，这种随机性是无可预估的，同时还存在试验中因细菌感染或光照问题产生畸形苗而使少量植株中途死亡，致使苗数减少而产生试验误差。

表2 不同烟草杂交品种花药培养成苗株数差异

2．3 低温预处理时间和温光条件对烟草花药培养的影响 试验的花药预处理时间为1～3 d，在培养过程中如花药处理时间在2 d内，消毒则会正常进行，若超过2 d甚至3 d，花药消毒过程中则会严重伤到花萼和花冠，甚至感染到花药。这可能与花蕊的保鲜性有关，致使花蕾失活萎蔫失去对花药的保护能力。所以花药最适处理时间为1～2 d。

花药接种在培养基后，移至25℃左右的培养室中培养，每天光照12 h，超过3 d左右，花药由嫩绿色变为淡黄色，接着又变为黄褐、褐色，花药体积不断膨胀，10～15 d花药裂开并伴随乳白色胚状体的出现，并逐渐发育成小植株。但也不全是按照上述理论时间段来发展，有的花药长达3个月以上才形成小植株。若花药培养温度在20℃以下，花药不仅难以萌发，萌发出的烟苗也难以成活，且在光照不足的情况下还易形成白化苗、玻璃苗等，影响花药培养的成效。

3 结论与讨论

随着现代生物科技的进步，烟草花药培养技术已获得稳定的发展，尤其是常规烤烟品种花药培养。而目前烤烟面临的大面积病害与烟叶质量恶劣等问题迫使人们为获得既抗病又优质的烟叶而不断探索更加简捷有效的方针。该试验利用高钾杂交品种进行烟草花药培养，结果表明，3个杂交品种的烟草花药均能萌发出胚状体并长出正常植株，尽管伴随着个体差异，但正因为这些差异才体现出品种间的特异性。

在不同品种花药萌发诱导率的对比中，云87×GK3和K326×GK3的萌发率趋于相近，明显高于G80×GK5，这可能与GK3和GK5品种间的差异有关。有研究表明单倍体培养的胚产量和质量是由基因型决定的，是影响单倍体培养的主要因素［4］。而在后来的单个花药培养成苗株数的对比中，各个品种依然存在差异，其差异趋势又与花药萌发诱导率截然不同，没有明显的规律，该现象不能单单追溯品种的基因问题，更与试验过程中操作不当造成花药感染失活产生的误差有关。

通过近几年的发展可以看出，烟草花药培养必将在烟草遗传育种研究中占据不可替代的地位，但是烟草花药培养技术有待改善和提高。应充分了解花药培养过程中的有利因素，如花药培养的最适时期［5］、预处理温度与时间［6］、激素的种类及适当的浓度配比［7］、培养基添加活性炭效应［8］、接种植株的生长环境控制等对花药培养效果的影响，提高胚状体的诱导频率。此外，花药培养出的纯系品种在后代中可能表现出基因的不稳定性，使品种发生变异，因此，应结合花药培养技术的改进来削弱后期的变异，或者为花药培养品种寻求更多稳定可行的技术。

［1］GERMANA M A．Anther culture for haploid and doubled haploid production［J］．Plant Cell Tiss Organ Cult，2011，104:283 －300．

［2］GUHA S，MAHESHWARI S C．in vitro production of embryos from anthers of Datura［J］．Nature，1964，204:497．

［3］贾兴华．细胞工程在烟草品种改良上的应用［J］．中国烟草学报，1991(1):40－45．

［4］付迎军，任海祥，白艳凤，等．糖液预处理对提高玉米花培诱导率的研究［J］．玉米科学，2004，12(1):111 －113．

［5］陈晓，詹玉丝，齐卫强．建立辣椒DH纯系中花药培养的研究［J］．辣椒杂志，2003(3):17 －20．

［6］陈春艳，刘仁祥，雷红梅，等．低温预处理对烟草花药培养诱导率的影响［J］．贵州农业科学，2010，38(5):16 －18．

［7］欧阳俊闻，胡含，庄家骏，等．小麦花粉植株的诱导及其后代的观察［J］．中国科学，1973(1):72 －82．

［8］刘仁祥，雷红梅，焦剑，等．烟草花药培养中活性炭的作用机理及替代配方研究［J］．西南农业学报，2007(4):762－767．