许家洁 于江波 徐军 仲崇琳 杨美林700吉林敖东集团力源制药股份有限公司700吉林敖东延边药业股份有限公司00吉林省中医药科学院

钩藤总生物碱的含量测定研究

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目的：建立测定钩藤总生物碱含量的方法。方法：用紫外分光光度法测定钩藤总生物碱提取物中的钩藤总生物碱含量。采用高效色谱法测定钩藤总生物碱提取物中的钩藤碱含量。结果：钩藤碱的进样量0.168～0.840μg，其峰面积与进样量具有良好的线性关系（r=0.9995），平均回收率98.98％，RSD=1.31（n=5）。结论：该方法灵敏、准确，可用于钩藤总生物碱的含量测定。

钩藤总生物碱；高效液相色谱法；分光光度法；含量测定

钩藤总生物碱主要包括4种生物碱，即钩藤碱（Rhynchophylline）、异钩藤碱（Isorhynchophylline）、去氢钩藤碱（Corynoxeine）（异名柯诺辛因碱）、异去氢钩藤碱（Isocorynoxeine）（异名异柯诺辛因碱）。其中钩藤碱与异钩藤碱、去氢钩藤碱与异去氢钩藤碱分别为同分立体异构体，这些生物碱均为吲哚型生物碱[1]。钩藤总生物碱具有明显的降压活性[2]，系钩藤药材主要的活性成分。为了测定钩藤总生物碱提取物中钩藤总生物碱和钩藤碱的含量，笔者采用紫外分光光度法测定了钩藤总生物碱提取物中的钩藤总生物碱含量；采用高效色谱法测定了钩藤总生物碱提取物中的钩藤碱（Rhynchophylline）含量，现报告如下。

资料与方法

仪器：日本岛津LC-10A高效液相色谱仪；岛津SPD-10A紫外检测器，N2100液相色谱工作站。

药品与试剂：钩藤总生物碱；钩藤碱对照品；甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

方法：分光光度法测定钩藤总生物碱提取物中钩藤总生物碱含量。①仪器与试药：752型紫外光栅分光光度计；钩藤碱对照品：自制，纯度＞99％。对照品溶液的配制：精密称取对照品适量，加2％盐酸溶液制成含钩藤碱100μg/mL的溶液，作为对照品溶液。②标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于10mL量瓶中，用2％盐酸溶液稀释至刻度。以相应的溶剂为空白，根据分光光度法（《中国药典》2010年版一部附录VC）试验，在250nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线[3]。③供试品溶液的制备与测定：取本品25mg，置于50mL量瓶中，加2％盐酸溶解并稀释至刻度。精密吸取2mL，置于100mL量瓶中，用2％盐酸溶液稀释至刻度。依照标准曲线的制备方法自“以相应的溶剂……”起依法操作，测定供试品吸收度，由标准曲线计算含量，即得。④方法学考察：最大吸收波长确定：分别吸取钩藤碱对照品溶液（50μg/mL），钩藤总生物碱样品供试液（100μg/mL），在190～400nm波长范围内，对钩藤碱对照品和钩藤总生物碱样品进行紫外扫描以确定测定波长。⑤标准曲线的绘制：取钩藤碱对照品5.60mg置于50mL量瓶中，加2％盐酸溶液溶解，稀释至刻度，作为对照品溶液，精密吸取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于10mL量瓶中，用2％盐酸溶液稀释至刻度[4]。于波长250nm处测定不同浓度的吸收度，以吸收度、浓度作图。⑥稳定性试验：按“供试品溶液的制备与测定”项下方法操作，对同一的供试液每隔一段时间测定吸收度。⑦精密度试验：对同一供试液，连续测定5次，由标准曲线计算含量，计算RSD[5]。⑧重现性试验：对同一批次钩藤总生物碱提取物，制备5份供试液，测定吸收度，由标准曲线计算含量。⑨回收率实验：在已知含量的钩藤总生物碱提取物（含量75.49％）中，定量加入钩藤碱对照品，按样品测定方法操作，计算回收率。⑩按上述方法测定了5批原料药。

高效液相色谱法测定钩藤碱含量：①色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；甲醇-0.02％三乙胺溶液（70：30）为流动相；检测波长250nm。理论板数按钩藤碱峰计算，应≥3000[6-7]。②对照品溶液的制备：精密称取对照品适量，加甲醇制成每1mL中含钩藤碱50μg的溶液，作为对照品溶液。③供试品溶液的制备：精密称取50mg置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，称重，超声处理5min，再称重，用甲醇补足，作为供试品溶液。④线性关系考察：精密吸取钩藤碱对照品溶液（56μg/mL），分别进样3、6、9、12、15μL，按上述条件测定，以峰面积积分值为纵坐标，钩藤碱浓度为横坐标，绘制标准曲线。⑤精密度试验：取同一供试品溶液，连续进样5次，每次10μL，测各次峰面积，计算RSD。⑥稳定性试验：精密吸取同一批号供试品溶液，按上述含量测定方法测定，每隔2h进样1次，测定峰面积，计算RSD。⑦重现性试验：取同一批号样品，按含量测定方法进行多次测定，计算RSD。⑧回收率试验：在已知含量12.34％的钩藤总生物碱提取物中，定量加入钩藤碱对照品，按样品测定方法操作，计算回收率。⑨样品含量测定：根据上述方法测定5批样品。

结果

分光光度法测定钩藤总生物碱提取物中钩藤总生物碱含量。标准曲线回归方程Y=-9.8×10-3+0.058X，r=0.9985，线性范围2.24～11.20μg/mL，见表1。

稳定性试验：吸收度值2.5h内稳定，见表2。

表1 标准曲线测定结果

表2 稳定性试验结果

表3 加样回收率测定结果

表4 5批样品中钩藤总生物碱含量测定结果

表5 回收率试验结果（n=5）

表6 5批钩藤总生物碱提取物中钩藤碱含量测定结果

精密度试验：RSD=0.19％（n=5）；重现性试验：RSD=1.23％（n=5），表明本方法有较好的重现性；回收率试验结果，见表3。

5批原料药测定结果，见表4。

高效液相色谱法测定钩藤碱含量：线性关系考察：回归方程Y=-4700.40+361502.38X，r=0.9999，线性范围0.168～0.840μg；精密度试验：RSD=1.97％（n=5），表明测定仪器精密度良好；稳定性试验：RSD=0.87％（n=5）；重现性试验：RSD=2.14％（n=5），表明方法重现性良好；回收率试验结果，见表5。

5批样品测定结果，见表6。

讨论

最大吸收波长确定，分别吸取钩藤碱对照品溶液（50μg/mL），钩藤总生物碱样品供试液（100μg/mL），在190～400nm波长范围内，对钩藤碱对照品和钩藤总碱样品进行紫外扫描，结果钩藤碱对照品和钩藤总碱样品均在250nm处有最大吸收，故确定λS=250nm为测定波长。

钩藤碱（Rhynchophylline）与异钩藤碱（Isorhynchophylline）系同分异构体，根据前期研究，我们发现两种结构在甲醇溶液中存在着相互转化的现象，造成钩藤碱测定结果的变化，因此在配制样品溶液过程中，应避免甲醇的使用。

[1]焦扬,王模强,华丹,等.中药钩藤化学成分研究[J].天津医科大学学报,2013,19（2）：107-109.

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[3]钟帼歆,富志军.钩藤中钩藤总生物碱的含量测定[J].中医药临床杂志,2012,24（8）：781-782.

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[5]王英锋,魏璐雪,王保中.高效液相色谱法测定钩藤中钩藤碱、异钩藤碱含量[J].药物分析杂志,1999,19（1）：56-57.

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Content determ ination exploration of uncaria totalalkaloid

Xu Jiajie1,Yu Jiangbo2,Xu Jun3,Zhong Chonglin3,YangMeilin3
Liyuan Pharmaceutical Limited Liability Company ofAodong Group in Jilin 1337001
Yanbian Pharmaceutical Limited Liability Company ofAodong in Jilin 1337002
Jilin Province Academy ofTraditionalChineseMedicine 1300123

Objective：To establish themethod for content determination ofuncaria totalalkaloid.Methods：The contents ofuncaria totalalkaloid from uncaria totalalkaloid extractivewere determined by ultravioletspectrophotometry.The contents ofuncaria total alkaloid from uncaria total alkaloid extractive were determined by HPLC.Results：The incoming sample amount of uncaria total alkaloid was 0.168～0.840μg,the peak area and incoming sample amount had good linear relationship（r=0.9995）,the average recovery was 98.98％,RSD=1.31（n=5）.Conclusion：Thismethod was sensitive and accurate,which could be used for the content determination ofuncaria totalalkaloid.

Uncaria totalalkaloid；High Performance Liquid Chromatography；Spectrophotometry；Contentdetermination

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.10.2