邵信儒，孙海涛，姜瑞平，徐 晶，于 淼，朱俊义*

（1.通化师范学院制药与食品科学学院，长白山食用植物资源开发工程中心，吉林 通化 134000；2.通化师范学院 长白山非物质文化遗产传承协同创新中心，吉林 通化 134000；3.通化师范学院生命科学学院，吉林 通化 134000）

短梗五加果花色苷微球的制备及其缓释效果评价

邵信儒1,2，孙海涛1,2，姜瑞平1，徐 晶1，于 淼1，朱俊义3,*

（1.通化师范学院制药与食品科学学院，长白山食用植物资源开发工程中心，吉林 通化 134000；2.通化师范学院 长白山非物质文化遗产传承协同创新中心，吉林 通化 134000；3.通化师范学院生命科学学院，吉林 通化 134000）

为探索短梗五加果花色苷微球的制备工艺，提高其稳定性，以短梗五加果花色苷为芯材，以海藻酸钠和壳聚糖为壁材，采用锐孔法制备短梗五加果花色苷微球。通过单因素试验考察了不同因素对短梗五加果花色苷微球包埋效率影响，采用Box-Behnken设计和响应面法优化了短梗五加果花色苷微球的最佳工艺条件。结果表明：海藻酸钠质量分数1.9%、壳聚糖质量分数1.7%、氯化钙质量分数1%和壁芯比4∶1的条件下，包埋效率可达92.9%。锐孔法制备得到的短梗五加果花色苷微球呈球形，大小均匀，在人工胃液和肠液中具有一定的缓释效果。

短梗五加果；花色苷；微球；锐孔法；缓释

短梗五加果是一种药食同源食品，含有丰富的黄酮、多糖、维生素、矿物质、必需氨基酸、超氧化物歧化酶等成分[1-2]，短梗五加果呈紫黑色，花色苷含量较高。研究表明，花色苷具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、保护心脑血管、改善视力、抗辐射、提高免疫等功效[3-6]，但是由于其易受pH值、温度、光照、金属离子等因素的影响而发生降解[7-8]，影响了其在食品、保健品、化妆品和医药领域的应用。因此，可通过某些方法将花色苷有效保护起来，增加其稳定性，扩大应用范围。

微胶囊技术是采用天然或合成的高分子材料将敏感的物质包埋在一个密闭的胶囊中，减少被包埋的物质与外界环境的接触，较好地保持原有的生物活性且具有一定的缓释效果[9-10]。杨玉峰等[11]对比研究了微胶囊化与未微胶囊化的姜黄色素稳定性，结果表明：经过微胶囊的姜黄色素溶解性明显提高，对温度、光照、VC、山梨酸钾和pH值的稳定性都有所提高。曹龙奎等[12]采用喷雾干燥技术以玉米黄色素为芯材，辛烯基琥珀酸淀粉酯和β-环糊精为壁材制备微胶囊，经微胶囊化的玉米黄色素对光、热、pH值和金属离子等的敏感性得到了改善。汤倩倩[13]的研究也表明微胶囊化后的蓝靛果红色素稳定性有较大改善。由于短梗五加果花色苷含有不饱和键和易氧化的官能团，性质不够稳定，在加工和贮藏过程中易发生变化，限制了其在食品、化妆品、药品领域的进一步应用。目前，提高花色苷稳定性的方法主要有微胶囊化、辅色化、分子结构修饰和基因调控技术[14-17]。本研究采用微胶囊锐孔法制备短梗五加果花色苷微球，对其表观结构进行观察，并研究了其在人工胃液、肠液中的缓释效果，以期扩大短梗五加果花色苷使用范围及拓宽短梗五加产业链，并为提高短梗五加浆果的附加值提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

短梗五加果花色苷 实验室自制[18-19]；海藻酸钠（黏度≥0.02 Pa·s） 上海国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖（黏度≥50 mPa·s，脱乙酰度95%） 玉环县海洋生物化学有限公司。

1.2 仪器与设备

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器厂；DC-1500喷雾干燥机 上海达成实验设备有限公司；722S型可见光分光光度计 上海棱光技术有限公司；AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；XSP-2C型生物显微镜 上海光学仪器厂；DZF-6020型真空干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 短梗五加果花色苷的制备

参照文献[18-19]的方法制备短梗五加花色苷，所得样品避光冷藏备用。

1.3.2 锐孔法制备短梗五加果花色苷微球工艺流程

将一定量的壳聚糖和氯化钙用1%的乙酸溶解制成凝固浴，待用；加入一定量的海藻酸钠和蒸馏水，50 ℃磁力搅拌30 min，充分溶解、冷却至室温后加入一定量短梗五加果花色苷，混匀，用孔径为0.45 mm的注射器将其滴入到上述凝固浴中，放在摇床上包埋30 min。抽滤后分离出湿胶囊，用清水洗净表面残留的氯化钙，置于真空干燥箱内干燥，得到短梗五加果花色苷微球。

1.3.3 花色苷含量的测定

取1 mL提取液，分别用pH 1.0的缓冲溶液和pH 4.5缓冲溶液稀释至一定体积，在525 nm波长条件下用1 mL比色皿测定其吸光度[20]。

式中：A0为pH 1.0时花色苷在525 nm波长处的吸光度；A1为pH 4.5时花色苷在525 nm波长处的吸光度；V为提取液总体积/mL；n为稀释倍数；M为矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量（449）；ε为消光系数（26 900）；m为样品质量/g。

1.3.4 包埋效率的计算[21]

式中：M1为微球总花色苷的含量/mg；M2为微球表面花色苷的含量/mg。

1.3.5 微球总花色苷含量的测定

称取短梗五加果花色苷微球0.2 g，放在研钵中，加入pH 3的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液少许，研磨、破碎后转移到10 mL容量瓶中，定容，4 000 r/min离心10 min后，计算总花色苷的含量。

1.3.6 微球表面花色苷含量的测定

称取短梗五加果花色苷微球0.2 g，用75%乙醇溶液反复冲洗微球表面，收集滤液并定容到10 mL容量瓶中，4 000 r/min离心10 min后，计算花色苷的含量。

1.3.7 短梗五加果花色苷微球制备的单因素试验

考察海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙质量分数以及壁芯比（以海藻酸钠和壳聚糖为壁材，以短梗五加果花色苷为芯材）对短梗五加果花色苷微球包埋效率的影响，以短梗五加果花色苷微球包埋效率作为评价指标。当对其中一个因素进行研究时，其余各因素的取值分别为海藻酸钠质量分数2%、壳聚糖质量分数1%、氯化钙质量分数2%、壁芯比3∶1。

1.3.8 短梗五加果花色苷微球制备工艺优化

表1 响应面试验因素水平表Table1 Factors and levels used in response surface design

根据单因素试验结果和Box-Behnken试验设计原理，以海藻酸钠质量分数（A）、壳聚糖质量分数（B）、氯化钙质量分数（C）和壁芯比（D）为自变量，以短梗五加果花色苷微球包埋效率（Y）为响应值，进行响应面试验设计，各因素变化值及编码见表1，研究各影响因素与短梗五加果花色苷微球包埋效率之间的内在规律性，预测锐孔法制备短梗五加果花色苷微球的最佳工艺。

1.3.9 颗粒形态观察

取适量短梗五加果花色苷微球置于显微镜上，观察短梗五加果花色苷微球的颗粒外观形态。

1.3.10 锐孔法制备短梗五加果微球体外缓释效果评价

人工胃液条件下的缓释效果：准确称取0.2 g短梗五加果微球，加入到50 mL、pH 1.2的人工胃液（含0.09 mol/L NaCl的0.01 mol/L HCl溶液）中，置于恒温振荡器中37 ℃、50 r/min，每隔30 min测定释放率。

人工肠液条件下的缓释效果：准确称取0.2 g短梗五加果微球，加入到50 mL、pH 7.4的人工肠液（含76.5 mmol/L NaCl的29 mmol/L磷酸缓冲液）中，置于恒温振荡器中37 ℃、50 r/min，每隔30 min测定释放率。

释放率计算如式（3）所示：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 海藻酸钠质量分数对短梗五加果花色苷微球包埋效率影响

图1 海藻酸钠质量分数对包埋效率的影响Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the entrapment effi ciency of anthocyanins

由图1可知，在海藻酸钠质量分数为1%～2%范围内，随着海藻酸钠用量的增加，短梗五加果花色苷微球包埋效率明显增加，在海藻酸钠质量分数为2%～3%范围内，继续增加海藻酸钠的用量，短梗五加果花色苷微球包埋效率有下降的趋势。这是因为海藻酸钠对短梗五加果花色苷微球的成型性有重要影响，海藻酸钠用量过低，形成的囊薄、弹性和机械强度差，在洗珠和干燥过程中易发生变形、破裂，造成短梗五加果花色苷的流失，使包埋效率降低；海藻酸钠用量过高，黏度过大，不利于短梗五加果花色苷的均匀分散，且在制珠过程中，下滴速率慢、拖尾严重，形成的短梗五加果花色苷微球较大，干燥效果不好，造成包埋效率的下降[22]。综合考虑，海藻酸钠质量分数为1.5%～2.5%范围内较适宜。

2.1.2 壳聚糖质量分数对短梗五加果花色苷微球包埋效率影响

图2 壳聚糖质量分数对包埋效率的影响Fig.2 Effect of chitosan concentration on the entrapment effi ciency of anthocyanins

由图2可知，在壳聚糖质量分数增加的情况下，包埋效率先上升后下降，在壳聚糖质量分数为1.5%时，包埋效率达到最高值。这是因为壳聚糖用量是决定短梗五加果花色苷微球形态和包埋效率的重要因素之一，壳聚糖是一种阳离子型天然高分子多糖聚合物，在1%的乙酸溶液中，分子链上的胺基带有正电荷，可吸附海藻酸钠中的羧酸钠盐形成的负电荷，形成凝胶复合物，这种复合物可增加聚电解质电荷密度，形成半透性膜，有效阻止未包埋的短梗五加果花色苷向外界扩散，可提高短梗五加果花色苷微球包埋效率；但壳聚糖用量过高，会增加凝固浴的黏度，导致短梗五加果花色苷微球在包埋过程中运动速率降低，包埋效果不好，影响的短梗五加果花色苷微球包埋效率，此外，当壳聚糖质量分数达到2.5%时，形成的短梗五加果花色苷微球粒径极不均匀，多数黏连在一起[23-24]。因此，选择壳聚糖质量分数1%～2%作为响应面的考察范围。

2.1.3 氯化钙质量分数对短梗五加果花色苷微球包埋效率影响

图3 氯化钙质量分数对包埋效率的影响Fig.3 Effect of calcium chloride concentration on the entrapment effi ciency of anthocyanins

由图3可知，随着氯化钙质量分数的增加，短梗五加果花色苷微球包埋效率有所提高，这是因为氯化钙质量分数较低时，Ca2＋与海藻酸钠的Na＋交换速率较慢，氯化钙与海藻酸钠交联程度较低，不能将短梗五加果花色苷完全包埋，同时，氯化钙用量不足，导致形成的囊壁较薄、成型性差；随着氯化钙质量分数的增加，氯化钙与海藻酸钠形成的骨架缝隙增多，有利于短梗五加果花色苷的有效包埋，形成的囊壁抗机械性能和弹性都变大，结构也变的更紧密，对短梗五加果花色苷的释放起到缓释作用；但氯化钙质量分数过高，氯化钙与海藻酸钠快速形成致密的交联结构，使囊壁变厚、变脆，不利于Ca2＋胶囊内部扩散，由此形成的短梗五加果花色苷微球质地坚硬，阻碍短梗五加果花色苷微球内部的充分包埋，在干燥过程中也容易破碎，导致短梗五加果花色苷微球包埋效率降低[25]。综合考虑，氯化钙质量分数为1%～2%范围内较适宜。

2.1.4 壁芯比对短梗五加果花色苷微球包埋效率影响

图4 壁芯比对包埋效率的影响Fig.4 Effect of wall/core material ratio on the entrapment effi ciency of anthocyanins

由图4可知，随着壁芯比的增加，短梗五加果花色苷微球包埋效率先明显提高后缓慢降低。这可能是因为一方面壁芯比过低，壁材用量少、芯材用量多，壁材不能将短梗五加果花色苷完全包埋，大量的短梗五加果花色苷暴露在壁材表面，造成短梗五加果花色苷的浪费，此外，壁材用量少，形成的囊壁薄，不能很好的保护内部的短梗五加果花色苷，导致包埋效率较低；另一方面，壁芯比过高，囊壁厚且致密，不利于干燥，且形成的微球有效成分含量低、颜色偏浅[26]。综合考虑，选择壁芯比2∶1～4∶1作为响应面的考察范围。

2.2 锐孔法制备短梗五加果花色苷微球响应面试验结果2.2.1 二次回归模型的建立与分析

以海藻酸钠质量分数（A）、壳聚糖质量分数（B）、氯化钙质量分数（C）、壁芯比（D）为自变量，以短梗五加果花色苷微球包埋效率（Y）为响应值，锐孔法制备短梗五加果花色苷微球的响应面分析试验结果见表2。

锐孔法制备短梗五加果花色苷微球的包埋效率与4 个变量的二次多项回归模型为：Y=89.02＋0.96A＋0.66B-2.32C＋0.35D-0.87AB＋2.05AC-2.90AD＋1.60BC＋2.25BD-4.05CD-4.16A2-0.41B2＋0.1C2-4.15D2。对此模型的回归方程方差分析见表3。

表2 响应面试验结果Table2 Results of response surface design

表3 回归方程方差分析表Table3 Analysis of variance for each term in the fi tted regression model

由表3可知，模型P值＜0.000 1，是极显著的，失拟项P=0.407 2＞0.05，不显著，模型的决定系数R2=0.974 4，说明模型响应值变化的97.44%来源于所选变量，试验的误差较小。噪音比为23.75＞4，说明此回归模型与试验数据拟合程度和可信度较高，可以用此模型分析和预测锐孔法制备短梗五加果花色苷微球包埋效率的变化。回归方程方差分析中各变量的P值表明：一次项A、C，二次项A2、D2和交互项AC、AD、BC、BD、CD对响应值（Y）的影响是极显著的（P＜0.01），一次项B对响应值（Y）的影响是显著的（P＜0.05），说明各种影响因素对于短梗五加果花色苷微球包埋效率的影响不是简单的线性关系。4 个因素中，对短梗五加果花色苷微球包埋效率影响最大的为氯化钙质量分数，其次为海藻酸钠质量分数，影响最小的为壳聚糖质量分数和壁芯比。

2.2.2 响应面交互作用

为考察各个因素交互对短梗五加果花色苷微球包埋效率的影响，将两个影响因素固定在零水平，分析另外两个因素的交互作用对短梗五加果花色苷微球包埋效率影响的三维空间响应面图见图5，不仅可以非常直观地看到各个因素之间的交互情况，还可以看到各因素对短梗五加果花色苷微球包埋效率的影响趋势，各交互作用对短梗五加果花色苷微球包埋效率的影响由大到小依次为CD＞AD＞BD＞AC＞BC＞AB，表明氯化钙质量分数和壁芯比两因素之间的影响最大。

图5 各因素交互作用对短梗五加果花色苷微球包埋效率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of four factors on the entrapment effi ciency of anthocyanins

2.2.3 锐孔法制备短梗五加果花色苷微球工艺条件的确定与验证

为确定锐孔法制备短梗五加果花色苷微球的最佳工艺条件，删除二次多项回归模型中的不显著项，在选取的各因素范围内，利用Design-Expert 8.0.6软件得到了包埋效率最高时的锐孔法制备短梗五加果花色苷微球工艺条件：海藻酸钠质量分数1.9%、壳聚糖质量分数1.7%、氯化钙质量分数1%、壁芯比4∶1。在此条件下，包埋效率最高，可达93.1%。为了验证模型的有效性，按照上述最佳工艺条件进行3 次平行实验，得到短梗五加果花色苷微球的平均包埋效率为92.9%，与理论预测值仅相差0.21%，说明结果是可靠的。

2.3 锐孔法制备短梗五加果花色苷微球颗粒形态观察

图6 短梗五加果花色苷微球颗粒形态Fig.6 Morphology of anthocyanins microspheres from Acanthopanax sessilifl orus (Rupr. Et Maxim.) Seem fruits

图6A为锐孔法制备的短梗五加果花色苷微球干燥前形态，图6B锐孔法制备短梗五加果花色苷微球干燥后显微镜下观察到的形态，其平均粒径为200～500 μm。如图6所示，短梗五加果花色苷微球呈球形，大小均匀，结构较完整，对短梗五加果花色苷有较好的保护作用。

2.4 体外缓释效果评价

图7 短梗五加果花色苷微球的释放率Fig.7 Release rate of anthocyanins microspheres from Acanthopanax sessilifl orus (Rupr. Et Maxim.) Seem fruits

由图7可知，短梗五加果花色苷微球在人工胃液和人工肠液中的释放率均随时间的延长而增加。在人工胃液中，随着时间的延长，短梗五加果花色苷微球的释放率增加缓慢，在270 min时释放率仅为42.8%，这是由于在酸性条件下，壁材的结构稳定，可较好地保护芯材短梗五加果花色苷，说明短梗五加果花色苷微球在人工胃液中具有较好的缓释效果；在人工肠液中，随着时间的延长，短梗五加果花色苷微球的释放率增加明显，在150 min时释放完全，这是因为壳聚糖分子中的氨基与海藻酸钠分子中的羟基的成膜作用受pH值影响较大，在碱性条件下，壳聚糖分子中的氨基质子化程度降低，导致壁材变薄，机械强度降低，易发生溶胀，随着时间的延长，使芯材完全释放出来，说明短梗五加果花色苷微球在人工肠液中也有一定的缓释效果。

3 结 论

通过单因素试验、响应面试验探讨了不同因素对锐孔法制备短梗五加果花色苷微球包埋效率的影响，确定了最佳工艺条件为海藻酸钠质量分数1.9%、壳聚糖质量分数1.7%、氯化钙质量分数1%和壁芯比4∶1，包埋效率为92.9%，锐孔法制备的短梗五加果花色苷呈球形，大小均匀，结构较完整、致密，有一定的机械强度，表面无裂痕。体外缓释效果研究表明，短梗五加果花色苷微球在人工胃液和肠液中具有一定的缓释效果。

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Preparation of Anthocyanins Microspheres from Acanthopanax sessilifl orus (Rupr. Et Maxim.) Seem Fruits and Evaluation of Their Sustained Release Performance

SHAO Xinru1,2, SUN Haitao1,2, JIANG Ruiping1, XU Jing1, YU Miao1, ZHU Junyi3,*
(1. Development Engineering Center of Edible Plant Resources of Changbai Mountain, College of Pharmaceutical and Food Science, Tonghua Normal University, Tonghua 134000, China; 2. Inheritance and Collaborative Innovation Center of Intangible Cultural Heritage of Changbai Mountain, Tonghua Normal University, Tonghua 134000, China; 3. College of Life Science, Tonghua Normal University, Tonghua 134000, China)

The objective of this work was to explore the preparation of anthocyanin microspheres with improved stability from Acanthopanax sessilifl orus (Rupr. Et Maxim.) Seem fruits. Using anthocyanins from Acanthopanax sessilifl orus (Rupr. Et Maxim.) Seem fruits as the core material and sodium alginate and chitosan as the wall material, microspheres were prepared by piercing method. The effects of different factors on entrapment effi ciency were studied. Box-Behnken central composite design and response surface analysis were used to optimize the factors. The results showed that when the wall material was composed of 1.9% sodium alginate, 1.7% chitosan and 1% calcium chloride with a wall/core material ratio of 4:1 (m/m), the entrapment effi ciency was 92.9%. The microspheres prepared by piercing were spherical and uniform in size, and exhibited sustained release effect in artifi cial gastric and intestinal juice.

Acanthopanax sessiliflorus (Rupr. Et Maxim.) Seem fruits; anthocyanins; microspheres; piercing method; sustained release

TS202.3

A

1002-6630（2015）22-0040-06

10.7506/spkx1002-6630-201522007

2015-05-22

吉林省科技发展计划项目（20140520182JH）；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2014556）；

吉林省“2011计划”长白山非物质文化遗产传承协同创新中心项目（[2013]6号）

邵信儒（1981—），女，讲师，博士，研究方向为食品天然产物提取及其功能性。E-mail：shaoxinru@126.com

*通信作者：朱俊义（1966—），男，教授，博士，研究方向为长白山植物结构学研究和长白山植物资源开发。E-mail：swx0527@163.com