ELISA试剂盒法与GC—MS法检测红酒中塑化剂的比较研究

2015-12-20曹必溥苗建银曹素芳谭荣威

食品与机械 2015年1期

曹必溥曹庸苗建银曹素芳刘果谭荣威

（1.华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642；2.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）

据法国国际葡萄酒与烈酒展览会公布的一项最新研究［1］，中国已超过法国和意大利，成为全球最大的红酒消费国。近年来酒类中塑化剂超标的问题引起了人们强烈关注，然而关于红酒中塑化剂检测的研究未见于报道。塑化剂又称增塑剂，是一种增加材料的柔软性或使材料液化的添加剂，其本质是一类邻苯二甲酸酯类化合物，主要是用于塑料制品中，增加塑料的弹性。研究［2－4］显示，塑化剂为激素类环境污染物，对人体和动物均有一定的危害，可致癌、致畸及免疫抑制。

目前常用的塑化剂检测方法有：气相色谱［5－7］（GC）、高效液相色谱法［8，9］（HPLC）、气质联用法［10－13］（GC—MS）、液质联用法［14－16］（HPLC—MS）。然而在塑化剂检测中，不同试验样品的检测前处理具有较大差异，且可能对检测结果的准确性产生影响。相比上述常用的检测方法，ELISA试剂盒法是一种新型的检测方法。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应，以及酶的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的试验技术，但这种新型的塑化剂检测方法目前还没有广泛使用，其检测准确性有待验证和分析。本研究拟分别采用经典的检测塑化剂法——GC—MS法，与新型的快速检测方法——ELISA试剂盒法，对比分析红酒中的塑化剂含量，同时对GC—MS法样品检测前处理进行了改进，并以GC—MS法为标准来检验ELISA试剂盒法的检测效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红酒：某3种品牌，市售；

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）ELISA检测试剂盒：北京普赞生物技术有限公司；

SPE固相萃取小柱：迪马科技有限公司。

16种邻苯二甲酸酯类的混合标准品（文中所指的混标如无其他说明，均指此标准品）：邻苯二甲酸二甲酯（DMP）、邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二异丁酯（DIBP）、邻苯二甲酸二丁酯（DBP）、邻苯二甲酸二（2-甲氧基）乙酯（DMEP）、邻苯二甲酸二（4-甲基-2-戊基）酯（BMPP）、邻苯二甲酸二（2-乙氧基）乙酯（DEEP）、邻苯二甲酸二戊酯（DPP）、邻苯二甲酸二己酯（DHXP）、邻苯二甲酸丁基苄基酯（BBP）、邻苯二甲酸二（2-丁氧基）乙酯（DBEP）、邻苯二甲酸二环己酯（DCHP）、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（DEHP）、邻苯二甲酸二苯酯（DR）、邻苯二甲酸二正辛酯（DNOP）、邻苯二甲酸二壬酯（DNP）：迪马科技有限公司；

丙酮、正己烷、甲醇、甲基叔丁基醚：色谱级，迪马科技有限公司；

试验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

GC—MS：7890A-5975C型，安捷伦有限公司；酶标仪：EnSpire 2300型，铂金埃尔默仪器有限公司；纯水系统：POSEIDON-R70型，厦门锐思捷科学仪器有限公司；旋涡振荡器：XW-80A型，上海精科实业有限公司；低速离心机：DL-5-B型，中国上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 GC—MS法检测红酒中塑化剂

（1）样品预处理：准确量取5mL样品置于具塞玻璃管中，加入10mL体积比为1︰1的正己烷和甲基叔丁基醚混合液（简称混合萃取液），充分涡旋混合4min，4 000r/min离心20min，取上清液，再用10mL混合液萃取液重复提取2次，合并3次上清液，于40℃水浴中氮吹至近干，用正己烷定容至2mL，待净化。

（2）预处理样品净化：① 活化：向SPE小柱中加入1.0g无水硫酸钠，再依次加入丙酮5mL、正己烷5mL，弃去流出液；② 上样：加入待净化液，流速控制在1mL/min内，收集流出液；③ 洗脱：依次加入正己烷5mL、4%丙酮—正己烷溶液5mL，接收流出液，合并上样、洗脱流出液；④ 重新溶解：40℃缓慢氮气流条件下吹至近干，用正己烷定容至1 mL，供GC—MS检测。

（3）GC—MS检测条件：色谱柱：DB-5石英毛细管柱（30 m×0.25mm×0.25μm）；进样口温度：280℃；升温程序：初始温度80℃，保持1min，以20℃/min升温至220℃，保持1min，5℃/min升温至300℃，保持20min；载气：氦气，流速：1mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1μL；色谱与质谱接口温度：280℃；EI离子源，70eV；检测器温度：280℃；监测方式：选择离子扫描模式（SIM）；溶剂延迟：5min。

（4）GC—MS法检测塑化剂加标回收率分析：取1mL 1 mg/kg的混标添加到5mL红酒中即得加标量为1mg/kg的加标组，将加标组置于具塞玻璃管中，加入10mL混合萃取液，后续步骤同1.3.1（1）。加标组做2个平行试验。

（5）样品的检测：使用GC—MS对处理好的样品进行检测，每一个样品做2个平行试验。

1.3.2 ELISA试剂盒法检测红酒中塑化剂由于目前市售的塑化剂ELISA试剂盒都只能检测单一的塑化剂，故在本研究中仅选择了邻苯二甲酸二丁酯（DBP）ELISA试剂盒作为试验材料。其中洗涤工作液是用去离子水将试剂盒自带的浓缩洗涤液（10倍）按1∶9体积比进行稀释来配制的，样品稀释液是用去离子水将色谱纯甲醇按35∶65体积比进行稀释来配制的。

（1）检测前处理：在干净的玻璃试管中加入样品5mL，加入色谱纯的正己烷4mL，盖上，振荡3min，4 000r/min离心20min，取上清液1mL，于40℃水浴中氮吹至近干。吹干后用1mL 35%的甲醇重溶，转移至2mL装样瓶待测。

（2）样品的检测：将所需试剂从冰箱中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板。将不同样本对应的微孔按序编号，每个样本做2孔平行，并记录样本孔所在的位置。加样品50μL到对应的微孔中，加入DBP抗试剂50μL/孔，再加入DBP酶标物50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后37℃恒温培养箱中反应40min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300μL/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。加入显色液100μL/孔，用盖板膜盖板后置37℃恒温培养箱反应10min。加入终止液50 μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（5min内读完数据），测定每孔OD值。

（3）标准曲线的绘制：使用试剂盒自带的DBP标准品制作标准曲线，其标准品浓度分别为0.00，0.09，0.27，0.81，2.43，7.29mg/kg，具体操作见上述操作步骤。绘制标曲时采用双对数模型进行标准曲线的拟合。使用试剂盒自带的DBP标品制作标准曲线，以B的自然对数ln（B）为纵坐标，以标准溶液实际浓度C（mg/kg）的自然对数ln（C）为横坐标。吸光度比值按式（1）计算：

式中：

B——吸光度比值；

A——标准溶液或样本溶液在450nm波长处的平均吸光度值；

A0——0mg/kg标准溶液在450nm波长处的平均吸光度值。

1.3.3 GC—MS法和ELISA试剂盒法的比较分析

（1）两种不同前处理方法的比较分析：使用气质联用仪分别对GC—MS法前处理的样品和ELISA试剂盒法前处理的样品进行检测。每一种前处理方法做2次平行试验。

（2）GC—MS法和ELISA试剂盒法检测结果的比较分析：从某超市中随机选购3种不同品牌的红酒，分别采用本研究中建立的ELISA试剂盒法和GC—MS法检测红酒中塑化剂的含量，对两种方法的检测结果进行比较。每一种红酒进行检测时做2次平行试验。

2 结果与分析

2.1 GC—MS法加标回收分析

在本试验条件下，1mg/kg混标中的16种塑化剂均已分离开来，且峰形良好，见图1。通过对红酒进行加标处理，分析红酒加标回收率来验证该方法的精准度。其加标平均回收率为93.0%，最高为109.0%，最低为68.0%，其中常见塑化剂 DIBP、DBP、DEHP的回收率分别为80.0%，90.0%，90.0%，回收率的标准偏差在0.00～0.35（见表1）。较高的回收率以及较小的标准偏差表明本试验建立的红酒塑化剂GC—MS法检测精确度好，符合试验的要求。

图1 混标（1mg/kg）在SIM扫描模式下的总离子流色谱图Figure 1 The chromatograms of 16phthalate esters under SIM mode

2.2 GC—MS法和ELISA试剂盒法的比较分析

2.2.1 两种不同前处理方法的比较分析采用两种不同的前处理方法对样品进行前处理，通过GC—MS进行检测，得出红酒中所含塑化剂的主要种类为DIBP、DBP、DEHP（见图2）。两种不同前处理方法的处理过程中有很大不同，但其检测值却相差不大（表2），说明两种前处理方法对于塑化剂的萃取效果较为一致，故ELISA试剂盒法前处理能够将塑化剂从样品中很好地萃取出来。

表1 混标在红酒中的加标回收试验Table 1 Results of the PEAs standard recovery test in red wine

添加水平1.0mg/kg。

序号化合物名称加标回收率序号化合物名称加标回收率1 DMP 0.68±0.08 9 DHXP 1.04±0.13 2 DEP 0.85±0.13 10 BBP 0.96±0.06 3 DIBP 0.80±0.10 11 DBEP 1.04±0.08 4 DBP 0.90±0.00 12 DCHP 0.97±0.01 5 DMEP 0.90±0.11 13 DEHP 0.90±0.06 6 BMPP 0.94±0.05 14 DR 0.87±0.10 7 DEEP 0.97±0.16 15 DNOP 1.06±0.16 8 DPP 0.96±0.02 16 DNP 1.09±0.35

图2 不同前处理法的红酒在SIM扫描模式下的总离子流色谱图Figure 2 The chromatograms of red wine under SIM mode for different pre-treatment methods

2.2.2 GC—MS法和ELISA试剂盒法检测结果的比较分析

（1）制作DBP标准曲线：使用试剂盒自带的DBP标品制作标准曲线，得到标准曲线方程：y＝－1.041 2ln（x）＋0.168 9，R2＝0.990 9（见图3）。

表2 两种不同前处理法GC—MS检测值Table 2 The GC—MS detection of two different pre-treatments （mg·kg－1）

图3 DBP标准曲线Figure 3 DBP standard curve on color results

（2）检测结果的比较分析：将3种不同品牌的红酒，编号为A、B、C，分别采用试剂盒法和GC—MS法进行检测。其检测结果的比较见表3。由表3可知，试剂盒法的检测值比GC—MS法的检测值要大3.4～5.5倍。其原因可能是试剂盒法在检测过程中采用的是人工操作，受外界的影响较大，而GC—MS法在检测过程中完全是由仪器的自动运行，外界干扰对其影响很小。故比GC—MS法的检测值大3.4～5.5倍，在可接受范围内。

表3 试剂盒法与GC—MS法的对比分析Table 3 ELISA kits and GC—MS for comparative analysis of plasticizers in red wine

3 结论

本研究中建立的GC—MS法对于红酒中塑化剂的检测具有高精准度，能够准确地检测样品中塑化剂的具体含量。由于ELISA试剂盒法是基于酶联免疫反应，而酶联免疫反应自身具有很强的特异性，故ELISA试剂盒法可以对样品中塑化剂进行定性分析。通过将ELISA试剂盒法对DBP的检测结果与GC—MS法的比较分析，发现试剂盒法的检测值比GC—MS法的检测值要大3.4～5.5倍，但考虑到试剂盒法在检测过程中采用的是人工操作，受外界的影响较大，而GC—MS法在检测过程中完全是由仪器的自动运行，外界的干扰对其影响很小，故ELISA试剂盒法的检测结果是可以接受的，因此邻苯二甲酸二丁酯（DBP）ELISA试剂盒能够对红酒中的DBP进行快速的初步定量分析。在本研究中通过GC—MS法检测到红酒中主要含有3种塑化剂（DIBP，DBP，DEHP），但只对邻苯二甲酸二丁酯（DBP）进行了酶联免疫检测，研究结果只能说明DBP的ELISA试剂盒法符合快速检测的要求，但不能验证其他塑化剂ELISA试剂盒法的检测效果。本研究对红酒中塑化剂的分析检测具有参考意义和实际应用价值。

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