赵玉萍 唐梓鑫 杨 莉 冯云琪

（淮阴工学院生命科学与化学工程学院，江苏 淮安 223001）

凹凸棒石黏土是一种具有一维纳米棒晶结构的天然非金属富镁铝硅酸盐黏土矿物，简称凹土。凹土显微结构包括3个层次：凹土的基本结构单元是微棒状或纤维状的一维纳米结构，是针状晶体；由棒晶结构紧密平行聚集而形成了棒晶束；棒晶束间或棒晶间相互聚集堆积成了各种层链状的聚集体［1－3］。由于凹土晶体颗粒细小，因此外表面积很大，而其特有的晶体结构和堆积方式又形成了大量的孔道结构，因此内表面积也很大，使得凹土具有很强的吸附能力［1，2］。另外，凹土还具有很好的生物亲和性［3］以及减少益生菌受胃肠道逆环境的损伤［4，5］。目前鲜有关于凹土对益生菌吸附性能和保护机理的报道。本研究拟优化凹土对乳酸球菌的吸附条件，并对相关吸附性能进行研究，旨在为凹土作为益生菌保护剂的机理研究作一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳酸球菌：本实验室保藏；

紫外光栅分光光度计：752型，上海精密科学仪器有限公司；

台式高速冷冻离心机：TGC-16G-A型，上海安亭科学仪器厂；

恒温双向磁力搅拌器：90-3型，上海振荣科学仪器有限公司；

MRS培养基［6］：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二铵2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，吐温-80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，H2O 1L，pH 6.2～6.4，121℃灭菌15min；

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖：生化试剂，日本Sigma公司；

其他试剂：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 凹土的纯化 将未经处理的凹土研磨，过200目筛，以10%的量加入去离子水，磁力搅拌器搅拌24h后，静置4 h，取中间层凹土悬液，以10%的量加入去离子水，重复3次［4］。

1.2.2 菌悬液的配置 取10mL对数生长期中后期菌液，此时，菌悬液在600nm处测定吸光度OD值为1.3左右，菌落为1.68×1010CFU，于5 000r/min离心10min，弃上清，用无菌生理盐水洗涤深沉两遍，最后将菌体悬浮于生理盐水中，配制成所需浓度。

1.2.3 离心条件的确定 将OD值相近的菌悬液和凹土悬液分别置于不同离心管，并分别加入80%的蔗糖溶液，离心，测上清液OD值。当凹土悬液上清液OD值接近于0而菌悬液上清液OD值与原来接近时，该离心条件作为测定吸附的条件［7］。

1.2.4 凹土活化最佳酸碱的确定 以浓度分别为0.6，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0mol/L 的 H2SO4、H3PO4、HCl、CH3COOH 和浓度分别为3.0，5.0，8.0，10.0，15.0mol/L的NaOH和KOH活化处理凹土，液固比为10∶1（V∶m），活化30min，再用生理盐水离心洗涤2次，待用［8，9］。

将活化好的凹土和菌悬液离心后的菌泥一起悬浮在10 mL的生理盐水中，振荡器充分混合均匀后转移到50mL三角瓶中，放置于37℃，150r/min的摇床上振荡2h。振荡结束后，取振荡后的混合液至离心管中，在最佳离心条件下离心，取上清液，测其OD值，确定凹土预处理的最佳酸或碱。

1.2.5 缓冲液最佳摩尔浓度的确定 将活化好的凹土和菌悬液离心后的菌泥一起悬浮在摩尔浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2mol/L的 NaH2PO4—Na2HPO4缓冲液中，按1.2.4确定最佳摩尔浓度。

1.2.6 缓冲溶液最佳pH和最佳吸附时间的确定 将活化好的凹土和菌泥一起悬浮在pH分别为6.0，7.0，8.0的无菌NaH2PO4—Na2HPO4缓冲液中，于37℃，150r/min的摇床上分别振荡20，40，60，80，100，120min，按1.2.4方法确定最佳pH。

1.2.7 吸附等温线的绘制 在上述最佳吸附条件下，将凹土悬浮于最佳缓冲体系中，浓度为4g/L，分别吸附浓度为4.4，4.8，5.2，5.6，6.0，6.4，6.8，7.2g/L的乳酸球菌，充分吸附，考察温度、菌体浓度对吸附的影响，绘制吸附等温线［10］。

2 结果与讨论

2.1 最佳离心条件的确定

凹土悬液和菌悬液OD值为1.269，在不同转速下离心不同时间后，测上清液OD值，所得结果见表1。

表1 不同离心条件下悬液的OD值Table 1 Determination of centrifugal conditions

由表1可知，当在800r/min离心2min时，菌的OD值接近起始值，说明菌基本没有沉降，而凹土OD值接近0，说明该条件下凹土基本沉降，故最佳离心转速为800r/min，离心时间为2min。

2.2 预处理凹土最佳酸或碱的确定

用不同浓度的酸和碱处理纯化凹土，再用预处理过的凹土吸附乳酸球菌，在800r/min离心2min，测上清液吸光度值，结果见图1、2。

图1 不同酸预处理凹土悬液吸光度值Figure 1 Results of different acids pretreating attapulgite

综合图1、2可知，用碱预处理凹土对乳酸球菌的吸附效果普遍不如酸。盐酸和硫酸预处理效果又不如磷酸和乙酸。由图1还可知，用浓度为1mol/L的磷酸处理凹土对乳酸球菌的吸附效果最佳，吸光度值最小。酸或碱预处理凹土，可除去分布于凹土微观孔道结构中的杂质，疏通孔道，从而有利于吸附过程中吸附质分子在孔道结构中的扩散。用酸处理的效果较好，还可能是因为H＋置换了凹土层结构中的阳离子，如Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋等，使孔容积得到了进一步增大，并且使原来层间的键力得到了削弱，使得层状晶格得到了一定程度的开裂，孔道得到进一步的疏通，比表面积得到了进一步的增加，提高了吸附能力［11］。

图2 不同碱预处理凹土悬液吸光度值Figure 2 Results of different alkalis pretreating attapulgite

2.3 缓冲液最佳摩尔浓度的确定

为探究磷酸缓冲液的摩尔浓度对凹土吸附乳酸球菌性能的影响，选择pH 6，研究缓冲液不同摩尔浓度对吸附效果的影响，测定上清液吸光度值，结果见图3。

图3 缓冲液的摩尔浓度对吸附效果的影响Figure 3 Effects of different concentrations of buffer on the adsorption

由图3可知，随着缓冲液摩尔浓度的增加，吸光度值先减少后增加，即凹土对乳酸球菌的吸附先增大，后减小，当缓冲液摩尔浓度为0.4mol/L时，吸附率达到最大，因此凹土吸附乳酸球菌时缓冲液的最佳摩尔浓度为0.4mol/L。

2.4 缓冲液最佳pH和最佳吸附时间的确定

选择摩尔浓度为0.4mol/L的磷酸盐缓冲液，研究不同的pH对凹土吸附乳酸球菌的影响，结果见图4。

由图4可知，pH＝6和7时，吸附在60min时基本达到饱和，而pH＝8时，吸附在40min就达到饱和，但饱和吸附效果没有微酸性和中性好，因此选择pH 6作为最佳吸附pH。同时可以看出，凹土对乳酸球菌的吸附，随着吸附时间的增加，吸附量先逐渐增大，然后趋于稳定，之后吸附量保持不变。前60min，凹土对乳酸球菌的吸附很快，之后吸附速度明显变慢，60min基本达到吸附平衡，因此凹土对乳酸球菌的最佳吸附时间为60min。

2.5 吸附等温线结果

选择几组不同浓度的乳酸球菌菌液进行等温吸附试验，以平衡质量浓度pe对平衡吸附量qe作图，得到凹土吸附乳酸球菌的吸附等温线，见图5。

图4 不同pH和时间的缓冲液对吸附效果的影响Figure 4 Effects of different pH of buffer and time on the adsorption

图5 吸附等温线Figure 5 Adsorption isotherm curve

由图5可知，随着温度的升高，凹土对乳酸球菌的吸附量增大，而且随着平衡浓度的增大，平衡吸附量先增大，然后趋于平缓。

按照公式和表中数据进行Langmuir和Freundlich方程线性拟合，结果见表2、3。

对比表2和表3可知，表2中理论推导的单层饱和吸附量qm与试验所得饱和吸附量q比较接近，且R12均普遍大于R22，因而在试验研究的温度和浓度范围内，凹土对乳酸球菌的吸附能够较好地符合Langmuir吸附等温方程。随着温度升高，单层饱和吸附量qm增大，表明此吸附是吸热过程，即升温有利于凹土对乳酸球菌的吸附。由于b＞0，且有0＜RL＝1/（1＋bp0）＜1，即凹土对乳酸球菌的吸附为优惠吸附。

表2 Langmuir线性拟合结果Table 2 The fitting results of Langmuir

表3 Freundlich线性拟合结果Table 3 The fitting results of Freundlich

3 结论

本研究对凹土进行纯化，研究了纯化凹土对乳酸球菌的最佳吸附条件。主要考察了吸附时间、缓冲液pH值、摩尔浓度以及温度等因素对凹土吸附乳酸球菌的影响。通过用H2SO4、H3PO4、HCl、CH3COOH、KOH 和 NaOH 预处理凹土可知，采用1mol/L的H3PO4预处理凹土，对乳酸球菌的吸附效果最好。在pH 6、0.4mol/L的磷酸盐缓冲液体系中，凹土对乳酸球菌的吸附在60min内基本完成，达到吸附平衡，是最佳的吸附条件。在试验的pH范围内，凹土对乳酸球菌的吸附速率随pH的升高而变慢，说明吸附适宜在偏酸性的条件下进行。凹土对乳酸球菌的吸附能够较好地符合Langmuir吸附等温方程。随着温度的升高，凹土对乳酸球菌的平衡吸附量增大，表明此吸附是吸热过程。当乳酸球菌的浓度增大时，平衡吸附量也在增大。凹土对乳酸球菌的吸附过程属于优惠吸附。

1 杨利营，盛京.凹凸棒粘土的研究开发应用［J］.江苏化工，2001，29（6）：33～37.

2 樊国栋，沈茂.凹凸棒粘土的研究及应用进展［J］.化工进展，2009，28（1）：99～105.

3 Xi-Jun Ma，Li-Hua Liu，Kai Zhu.Preparation and properties of modified attapulgite/polyurethane bioactive macromolecular carrier ［J］.Research on Chemical Intermediates，2012（38）：223～232.

4 赵玉萍，黄颖娟，吴洁，等.以凹土为载体的新型益生菌制剂的制备［J］.食品工业科技，2013（3）：141～144.

5 赵玉萍.以凹土为载体的益生菌制备方法：中国，201010248836［P］.2010—12—22.

6 郭本恒.益生菌［M］.北京：化学工业出版社，2004：22.

7 Xingmin Rong，Qiaoyun Huang，Xiaomin He，et al.Interation ofPseudomonasputidawith kaolinite and montmorillonite：a combination study by equilibrium adsorption，ITC，SEM and FTIR ［J］.Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2008（64）：49～55.

8 黄昭先.凹凸棒土吸附四环素的研究［D］.无锡：江南大学，2012.

9 傅正强.靖远凹凸棒石吸附水溶液中Cd（II）性能的研究［D］.兰州：兰州大学，2013.

10 赵玉萍，冯良东，李辉.白腐菌预处理稻壳灰吸附性能研究［J］.中国粮油学报，2010，25（10）：104～107.

11 许干，杜卫刚，周伟，等.改性凹凸棒土净化含铬废水的研究［J］.天津化工，2007，21（6）：58～60.