谭 萱 王嘉康 韩 维 张惠华 管文华 张 航 麦迪思 陈小佳＊

（1基因工程药物国家工程研究中心，广东省生物工程药物重点实验室，暨南大学生物医药研究院细胞生物学系，广州510632；2广州医科大学附属肿瘤医院，广州510095）

我国是食道癌的高发地区，每年因食道癌死亡者约15万人，占全部恶性肿瘤死亡近四分之一。食管癌肿瘤细胞生长迅速，一旦诊断出，一半以上的病人由于晚期而无法手术切除 ，即使采取切除手术，也只有不到1／4的病人可以有五年以上的存活率［1－3］，因此食管癌的防治非常重要。

肿瘤相关成纤维细胞（carcinoma－associated fibroblasts，CAF）是肿瘤微环境中最主要的间质细胞，对肿瘤的发展和恶化有促进作用，也使CAFs成为肿瘤治疗的新靶点［4］。目前关于食管癌肿瘤相关成纤维细胞的分离和鉴定没有快速有效的方法，个别实验室也凭经验进行分离没有相对标准的程序。因此本文参考其他肿瘤相关成纤维细胞的培养方法［5－8］，就食管癌肿瘤相关成纤维细胞的原代培养方法进行探索，建立了快速分离较纯的成纤维细胞的方法，也分离癌旁正常成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs），并且对细胞的细胞学特性进行了初步的评价和鉴定，比较CAFs和NFs的生长特性并检测基因FGFR2在CAFs和NFs中表达差异，为进一步实验奠定基础。

材料和方法

1.材料

1.1 主要试剂 细胞培养基DMEM（美国Gibco），胎牛血清（以色列Bioind），（Cell Counting Kit（CCK8））（日本同仁化学）fibronectin、Cytokeratin抗体（美国Dako）

1.2 组织来源 取新鲜食管癌肿瘤组织，在距离癌区域≥3cm取正常组织。0－4℃保存，2h内处理。

2.方法

2.1 组织处理在0－4℃的PBS中浸泡20min。

2.2 组织块法

将组织块剪碎为1mm3，15－20块小的组织块放入6cm培养皿中，加20%FBS的DMEM培养基，在37℃、5%CO2、培养每4－5d更换培养基，直到细胞长满整个培养皿。

2.3 酶消化法

将组织块剪至≤1mm3加入含0.02%EDTA的胰蛋白酶1.5ml，37℃消化8min，终止消化；取上清离心1000rpm 5min，弃上清用含20%FBS的DMEM培养基吹打混匀沉淀，转移至25cm2培养瓶中培养。

2.4 酶消化法和组织块法结合培养

前期处理和酶消化法一致，消化离心后将组织块和细胞沉淀一起收集，用含20%FBS的DMEM吹打混匀，将组织块和细胞沉淀一起置于7cm培养皿中培养，在相同的培养条件下培养。

2.5 细胞的纯化

与上皮细胞相比，成纤维细胞更易贴壁，将细胞悬液加到6孔板第一个孔中，静置20min，贴壁的细胞几乎均为成纤维细胞。其上清吸至第二个孔中静置20min，吸弃上清，两孔贴壁的细胞用含10%FBS的DMEM吹打混匀，37℃、5%CO2、培养，直至长满。

2.6 细胞传代

细胞长80%－90%后，胰酶溶液消化，用含10%FBS的DMEM吹打混匀并传代继续培养。

2.7 间接免疫荧光检测

常规方法细胞爬片处理后，4%多聚甲醛常温固定20min，0.1%Triton X－100 4℃ 穿透处理10min，4%BSA的PBS溶液于37℃封闭30min，孵fibronectin、Cytokeratin的抗体溶液，4℃过夜，阴性对照用PBS。第二天，PBST洗3次，孵二抗（避光）溶液37℃40min，PBST洗三次，加DAPI，室温10min，PBST洗三次。在每孔中加入少量的PBST（可避免荧光快速淬灭），荧光显微镜检测。

2.8 细胞增殖的测定

待CAFs／NFs细胞长满后，按照日本同仁化学公司的Cell Counting Kit（CCK8）说明书操作，测得细胞OD值绘制生长曲线。

2.9 细胞周期检测

分别收集NFs和CAFs（1×106个），加入预冷预冷70% 乙醇，4℃固定1h；RNaseA（终浓度0.25mg／ml）37℃ 消化30min；细胞染色：加入碘化丙锭（PI），室温避光染色30min，流式细胞仪检测，统计结果。

2.10 实时定量 RT－PCR

按照Takara公司SYBR说明书加样，反应条件为95℃预变性5min；变性95℃15s，退火60℃15s、延伸72℃15s，72℃10min重复40个循环，软件分析获得Ct值，并根据熔解曲线判断产物的纯度。

2.11 蛋白免疫印迹 Western blot

分别收集CAFs和NFs细胞，用用预冷的RIPA裂解液裂解后取上清，BCA细胞定量，12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS－PAGE）电泳，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭室温2h，孵一抗1∶2500稀释的FGFR2抗体、1∶10000稀释的β－actin抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜后，1∶3000稀释的二抗孵育室温1h，TBST洗膜后曝光。

结 果

1.人食管癌肿瘤相关成纤维细胞及癌旁成纤维细胞的分离培养和纯化

1.1 三种方法均可获得原代成纤维细胞

如图（1），组织块法获得成纤维细胞，最早7d左右有细胞在组织外游离出来，但此时细胞少有明显的纤维状，而是混杂着不规则的形态，10d左右可见较多的放射状的细胞。25d左右细胞可以70%－80%融合。

消化法获得的成纤维细胞，最早3d左右可见成纤维状细胞贴壁，获得细胞较少，混杂其他形态的细胞相对较少，20d左右细胞能70%－80%融合。

组织块和消化法结合培养法获得的成纤维细胞一般3d左右可见成纤维状细胞不同区域分布，且组织块外细胞开始有细胞游离出来混杂其他形态的细胞，细胞生长很快，12d左右可以70%－80%融合。

图1 三种方法均成功分离出原代细胞CAFs、NFs。Fig.1Three methods successfully isolated the primary cell CAFs、NFs。

1.2 细胞传代和纯化

培养的成纤维细胞首次传代消化所需要的时间稍长一些，癌旁正常组织长出的成纤维细胞即NFs一般传代可到8代左右，而CAFs可以传代到11代左右。初次获得的第一代细胞形态混杂，有不规则的上皮样细胞以及成纤维样细胞，经差时贴壁法初步纯化以及自然纯化后第三代的细胞就几乎不见上皮样细胞。

2.食管癌肿瘤相关成纤维细胞的鉴定

2.1 显微镜下细胞的形态观察

在显微镜下观察细胞的形态大多呈长梭形，细胞核呈卵圆形，细胞长满时呈现放射状或涡旋状，可覆盖生长。NFs和CAFs形态上存在差异，NFs细胞相对较小些，细胞呈现长梭形，CAFs放射状排列，细胞形态为梭形或星形。

2.2 细胞间接免疫荧光结果

CAFs和NFs中成纤维细胞marker：fibronectin阳性表达，上皮细胞marker：Cytokeratin阴性表达（图2）。阳性对照分别选择成纤维细胞3T3细胞及上皮来源的食管癌细胞KYSE30。

图2 细胞间接免疫荧光检测结果表明分离获得的细胞均为成纤维细胞。×200Fig.2Indirect immunocytochemical assay results indicate that the isolated cells are all fibroblasts.×200

2.3 细胞增殖检测根据细胞增殖检测试剂盒检测结果绘制细胞生长曲线

细胞生长的整体趋势呈现为S形，前两天细胞生长缓慢处于迟缓期，2－4d细胞生长迅速处于对数期，第5－6d开始细胞生长开始缓慢即细胞处于稳定期，根据CAFs和NFs的生长曲线可见CAFs细胞生长较NFs相比生长迅速（图3A）。

2.4 细胞周期检测结果

流式检测CAFs和NFs，分析细胞各时期的含量结果显示如图（3B）：CAFs与NFs相比，CAFs细胞的S期、G2M期增多，即细胞增殖快。该结果与细胞生长曲线结果一致。

图3 A.细胞增殖实验结果表明：CAFs细胞增殖比NFs要快。B.流式细胞仪检测细胞周期显示：CAFs与NFs相比，S、G2M期均增加。C.细胞周期检测统计分析。Fig.3A.cell proliferation experiment shows that CAFs are faster than NFs in cell rate.B.flow cytometry histogram shows that the percentages of cells in S and G2－M phases were significantly higher in TFs compared with NFs.C.statistic analysis of cell phases

图4 CAFs和NFs中FGFR2的mRNA和蛋白水平的检测。A.QPCR检测，B.western blot检测Fig.4The expression levels of FGFR2mRNA and protein were determined in the CAFs、NFs cells.A.QPCR detection；B.western blot detection

3.食管癌肿瘤相关成纤维细胞的FGFR2高表达的鉴定

3.1 实时定量RT－PCR检测FGFR2在CAFs和NFs基因水平中表达差异，结果如图（4，A）表明，在CAFs中FGFR2mRNA表达量明显比NFs高。

3.2 蛋白免疫印迹 Western blot检测FGFR2在CAFs和NFs蛋白水平的表达差异，如图（4，B）表明和定量检测结果一致，即CAFs中FGFR2蛋白表达比NFs高。

讨 论

细胞的原代培养一直存在较大难度，为了获得原代细胞必须克服污染问题，食管是一个开放性器官，其肿瘤组织易受细菌、霉菌的污染，所以较难培养［9］。本实验处理了30对标本，成功获得的细胞有24对，经鉴定已经明确获得的细胞均为成纤维细胞。早期进行方法的摸索之后，中后期的成功率达到100%，说明我们建立的方法是可行的，经验总结如下：

首先，从手术室无菌条件下取标本后立即放入无菌离心管中，冰上拿回实验室2h内处理标本。第二，处理标本时一定要用含双抗的PBS或者Hanks冲洗几遍，并去除组织块外面的血块及脂肪类组织，处理中组织块处于溶液状态中。第三，有组织块时，培养基不能太多，一般刚好使组织块可以半悬浮即可。除了加双抗外，初期一般用20%FBS的DMEM，等细胞传代后即可换回10%FBS的DMEM。最后，关于细胞的纯化，本实验采取的是差速贴壁法和自然纯化法的结合，最后第三代获得较纯的成纤维细胞，尽管有实验室是根据梯度离心和流式分选［10，11］，但操作麻烦，费时，处理的时间的增长会导致细胞污染的可能性增加。

通过本研究建立的方法，能顺利获得食管癌肿瘤相关成纤维细胞，为进一步研究食管癌肿瘤微环境中成纤维细胞的功能奠定了实验基础。

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