·论著·

托盘根生物碱对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

,吴磊,赵伟勋,杨明慧,陈爽*(

吉林医药学院，吉林 吉林132013)

摘要：目的研究托盘根水煎液生物碱降血糖的作用。方法通过超声波辅助法提取，用不同浓度乙醇精制得托盘根中总生物碱；通过建立体外α-葡萄糖苷酶抑制模型，用麦芽糖为底物，以阿卡波糖为阳性对照，测定托盘根中不同浓度生物碱对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。结果精制得总生物碱41.1 mg，得率为0.201%。75 g/L总生物碱抑制率是13.33%，50 g/L总生物碱抑制率是48.33%。结论托盘根总生物碱对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用,具有一定的降血糖活性。

关键词：托盘根;生物碱;降血糖

文章编号：1673-2995(2015)06-0428-03

中图分类号：R285.5

基金项目：大学生创新创业项目(201405),吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(20143620),吉林省科技发展计划自然科学基金项目(20140101142JC).

作者简介：官慧敏(1994-)，女(回族)，在读本科.

收稿日期：(2015-05-18)

Inhibition of Rubus crataegifolius Rge alkaloid on α-glycosidse enzymes

GUAN Huimin,JIN Minqi,WU Lei,ZHAO Weixun,YANG Minghui,CHEN Shuang*(Jilin Medical College,Jilin City,Jilin Province,132013,China)

Abstract:ObjectiveTo study the hypoglycemic action of Rubus crataegifolius Rge alkaloid in the water decotion. Methods Total Rubus crataegifolius Rge alkaloid was extracted and refined by different concentrations of ethanol with ultrasonic assistance.The inhibition alkaloids in different concentrations in the Rubus crataegifolius Rge onα-glycosidase enzyme were measured through the establishment of α-glycosidase enzyme inhibition model in vitro with maltose as the substrate and acarbose as positive control. Results41.1 mg of total alkaloid was refined at a rate of 0.201%.The inhibition rate of 75 g/L total alkaloid is 13.33%,while 50 g/L total alkaloid inhibition rate was 48.33%. ConclusionRubus crataegifolius Rge total alkaloid has certain inhibitory effect on α-glycosidase enzymes,Which mean it have a certain hypoglycemic activity.

Key words：Rubus crataegifolius Rge;alkaloids;hypoglycemic

通讯作者：陈爽(1982-)，女(回族)，讲师，硕士.

托盘(Rubus crataegifolius Rge)为蔷薇科悬钩子属植物，果和根入药。托盘根味苦、涩，性寒，有清热凉血、散结止痛、利尿消肿的功效,具有抗衰老、抗肿瘤、降压、降血糖、对组织脂质过氧化作用等[1]。研究发现托盘根水煎物具有明显降血糖作用，但具体起效成分未见报道，本实验拟从生物碱方面进行研究。

在天然药物中，少数弱碱性生物碱如酞胺类生物碱以游离的形式存在，多数中强碱性生物碱以有机酸盐形式存在，大多数游离生物碱不溶或难溶于水，能溶于氯仿、乙醚、醇和丙酮等有机溶剂，以水为溶剂，可将其提取出来。也可选0.1%～2%的硫酸、盐酸或乙酸等为溶剂，使原料中溶解度较小的生物碱有机酸盐转变为溶解度较大的无机酸盐，从而提高溶出率。以酸水提取多采用常温下浸渍法、渗法；以水提取还可以采用煎煮法。以水或者酸水提取生物碱，其提取液体积较大，浓缩困难，水溶性杂质较多。随着新的提取技术的发展，溶剂法提取生物碱还可以采用超声波提取、微波辅助提取、CO2超临界流体萃取以及生物酶解辅助提取等技术。而超声波辅助提取技术因其具有显著的高效性而越来越受到天然产物化学工作者的重视和青[2]。故在此采用超声波辅助提取生物碱。

1　材料与方法

1.1　主要试剂及仪器

托盘根购于药材市场，由吉林医药学院雷钧涛教授鉴定为蔷薇科悬钩子属植物托盘(Rubus crataegifolius Rge)的根，阿卡波糖(德国拜耳医药保健有限公司，批号：117816)；葡萄糖试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号：102151：201002)；麦芽糖、无水碳酸钠、磷酸盐等均为国产分析纯。

酶标仪(美国，BIO RAD/Model 680)；电热恒温水浴锅(中国，天津市泰斯特仪器有限公司/DK-98-I型)；微型植物粉碎机(中国，天津市泰斯特仪器有限公司/FZ102)；500 g摇摆式中药粉碎机(中国，温岭市奥力中药器械有限公司/AK-1000A)；电热恒温鼓风干燥箱(中国，上海精宏试验设备有限公司/DHG-946A型)；玻璃仪器气流烘干器(中国，巩义市予华仪器有限责任公司/KQ-C型)；玻璃匀浆机(中国，海门弘澄实验器材制造有限公司)；电子天平(中国，天津市天马仪器厂/TD20002；中国，沈阳龙腾电子有限公司/ESJ200-4B；德国，Sartorius/CAP2250)；低温离心机(中国，上海旦鼎国际贸易有限公司/Z36HK)；数控超声波清洗器(中国，昆明市超声仪器有限公司/KQ-100DB型)；电加热套(中国，天津市泰斯特仪器有限公司/98-1-B型)；循环水式真空泵(中国，巩义市子华仪器有限责任公司/SHZ-DⅢ)；旋转蒸发仪(中国，上海豫科教仪器设备有限公司/R201D)。

1.2　粗总生物碱制备

托盘根中生物碱提取：称取托盘根20.04 g于粉碎机中粉碎，过60目筛。按料液比1∶10加入水200 mL，水煎三次，滤过；残渣用1∶10的比例加入75%乙醇液，0.1 moL/L的盐酸调pH为2，先超声提取1 h，超声功率90%，在70 ℃水浴加热回流3次，每次1 h，合并提取液，浓缩至小体积再用饱和碳酸钠调pH为10～11，按1∶1的比例用氯仿萃取5次，每次20 mL，将得到的萃取液在旋转蒸发器上减压蒸馏回收氯仿，再将残留液于60 ℃水浴蒸干得41.1 mg总生物碱[3]。得出的浸膏分别用40%、50%乙醇溶液超声提取1 h，超声功率90%，在70 ℃水浴加热回流3次，每次1 h，浓缩至小体积，最终得到不同醇浓度的生物碱溶液。

(将得到的氯仿层加入0.5%盐酸，使其呈酸性，然后加入4种常用的生物碱沉淀试剂磷钨酸试剂、碘化钾试剂、碘化汞钾试剂和碘化钾试剂，通过实验现象来判定托盘根中是否有生物碱，同时也可以判定该工艺是否适合提取托盘根中的生物碱[4]。)

1.3　大鼠肠α-葡萄糖苷酶的提取

雄性Wister大鼠，空腹24 h，脱臼处死，沿腹白线解剖，取小肠大约20 cm，剪成5 cm/段，放在预冷的生理盐水中清洗干净，在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.8)中清洗，剪刀剪开小肠，干净玻片刮取小肠膜表面物质，加入约2倍量PBS，在玻璃匀浆器中匀浆，匀浆液低温离心机4 000 r/min离心20 min(4℃),离心后取上清液，分装进冻存管，-20 ℃冻存备用[5]。

1.4　托盘根生物碱对α-葡萄糖苷酶抑制作用

实验分为空白组﹑阴性对照组﹑阳性对照组和实验组，反应于96孔培养板上进行，反应体系均为200 μL。①空白组(缓冲液+底物)加入PBS 120 μL，20 μL的底物麦芽糖，用60 μL蒸馏水补齐200 μL；②阴性对照组(缓冲液+酶+底物)先加入PBS 120 μL和α-糖苷酶溶液20 μL，37 ℃反应10 min后加入底物麦芽糖(蔗糖)20 μL，40 μL蒸馏水37 ℃下反应15 min；③阳性对照组(缓冲液+酶+阿卡波糖+底物)先加阿卡波糖溶液40 μL和α-糖苷酶溶液20 μL，再加入PBS 120 μL和底物麦芽糖20 μL；④实验组(样品+缓冲液+酶液+底物)先加入不同浓度托盘根生物碱溶液40 μL和α-糖苷酶溶液20 μL，托盘根生物碱的终浓度分别为50和75 g/L，加入PBS 120 μL和20 μL的底物麦芽糖。反应后加入80 μL的0.2 moL/L碳酸钠终止反应，取反应液50 μL，分别加入200 μL的血糖试剂工作液中，37 ℃下反应30 min后在405 nm波长处测定吸光度A值并记录，计算抑制率[6]。抑制率(%)=(A酶活性对照-A样品)/(A酶活性对照-A空白对照)×100%[7]

1.5　酶活力的测定

以麦芽糖为底物，标准反应体系为：120 μL磷酸钾缓冲液(PBS，pH 6.8)，20 μL 0.2 U/mLα-葡萄糖苷酶，37 ℃恒温，15 min后加入麦芽糖20 μL，配成200 μL体系的溶液摇匀，37 ℃恒温反应15 min，再加入80 μL的0.2 moL/L碳酸钠溶液终止反应，于405 nm测OD值(酶活力单位定义：37 ℃、pH 6.8条件下，1 min水解底物生成1 μmoL麦芽糖所需的酶量，规定为一个酶活力单位[8])。

2　结　果

2.1　预试验的结果

在酸性提取液中分别加入4种生物碱沉淀剂时，有下列现象发生：加入磷钨酸有灰白色絮状沉淀生成；加入碘化钾有紫黑色沉淀；加入碘化汞钾静置后有浅黄色沉淀生成；加入碘化钾立即有橙黄色沉淀生成。因为4种沉淀剂都呈阳性反应，可以肯定托盘根中含有生物碱，同时也说明该流程适合托盘根中生物碱的提取[2]。

2.2　托盘根中生物碱对α-糖苷酶的活性测定

不同浓度醇提取的不同生物碱浓度的抑糖率见表1,由表1可见,托盘根生物碱40%和50%乙醇洗脱物均对在以麦芽糖为底物时对α-糖苷酶有一定的抑制作用，其中50 g/L总生物碱对α-糖苷酶抑制率最高。

表 1　不同浓度醇提取的不同生物碱浓度的抑糖率

3　讨　论

α-葡萄糖苷酶通过水解α-1，4糖苷键从多糖的非还原端切下葡萄糖，人体对淀粉、糊精、蔗糖等碳水化合物的利用吸收依赖小肠刷状缘上该酶的活性。目前已知，α-葡萄糖苷酶广泛存在于体内，是细胞中糖类代谢不可或缺的重要酶类，如糖蛋白的加工修饰、参与免疫应答与抗原提呈等反应，所以α-GI不仅可以防治糖尿病、肥胖症，还具有抗肿瘤和抗AIDS病毒的作用。因此，对α-GI的研究具有重要的临床意义[9]。

药用植物生物碱提取方法按提取条件不同可分为冷浸提取法、微波提取法、索氏提取法、膜提取法、回流提取法等。索氏提取是传统的提取方法，优点是提取效率比较高，提取过程简便，但提取时间长。微波浸提的优点就是提取时间短、温度较低，并且可以为植物有效成分大规模生产的提取分离提供合理化生产工艺、流程及参数，因此避免了长时间处于高温下的氧化，收率和产品质量都较传统方法高[10-11]。通过文献资料可知，一般当微波时间越长、功率越大，则提取率越高。但实验中提取效率不如索氏，原因可能是微波仪中溶液达到沸点温度时，便会提高沸腾频率同时扩大沸腾范围，容易使溶液冲入微波仪的冷凝管里，造成一定误差，因此当溶液达到一定温度时提取效率便要下降；当提取时间增加时，提取效率变化不大，由于微波对细胞膜的破碎作用随着功率和时间增加而逐渐增强，从而有利于提取；当微波强度进一步加强时其强热效应可对某些成分产生破坏作用，则不利于提取效率的提高；微波-超声波提取时提取剂容量受到限制，提取过程不容易控制，也是提取效率降低的原因之一[12]。通过文献资料[4]比较得出，料液比1∶10加入75%乙醇200 mL，超声提取1 h，超声功率90%，70 ℃水浴加热回流3次，能较多的提取出托盘根中的总生物碱含量[3]。

因为所测得的生物碱含量较多，所以最后建立了糖苷酶抑制模型，作用于底物麦芽糖，测定其抑制率，观察降血糖作用。生物碱沉淀反应要在酸水或酸性稀醇中进行，因为生物碱和生物碱沉淀试剂均可溶于其中，使反应易于进行且反应结果易于判断。用沉淀反应鉴别生物碱时，应注意假阳性和假阴性反应。仲胺一般不易与生物碱沉淀试剂反应，如麻黄碱。水溶液中如有蛋白质、多肤、质亦可与此类试剂产生阳性反应，故应在被检验的碱液中除掉这些成分。除掉方法是将酸水提取液碱化，以氯仿萃取，分取氯仿层，再用酸水萃取氯仿层，此酸水层除去了上述水溶性干扰物质，可作为沉淀反应用溶液。此外，对生物碱定性鉴别时，应用三种以上试剂分别进行反应，均阳性或阴性方有可信性[2]。

参考文献：

[1]李春华，及晓静，雷钧涛.托盘根功效研究进展[J].吉林医药学院学报，2014，35(3)：200-202.

[2]刘琳.天然药物中生物碱的提取分离及检测[J].黑龙江医药，2014，27(2)：462-466.

[6]张海凤，董亚琳，刘琳娜,等.大黄多糖对α-糖苷酶活性的抑制作用[J].医药导报，2010，29(8)：985-989.

[7]原源，黄光辉，李霞,等.阔叶五层龙根提取物对α-糖苷酶抑制活性的研究[J].药学实践杂志，2013，31(3)：185-186.

[8]康文艺，张丽，宋艳丽.滇丁香中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究[J].中国中药杂志，2009，34(4)：406-409.

[10]曾里，夏之宁.超声波和微波对中药提取的促进和影响[J].化学研究与应用，2002，14(3)：245-249.

[11]孝武，张福成，林书玉,等.超声技术在中草药成分提取中的应用[J].中草药，1993，24(10)：548-550.

[12]高淑云，焦灿.麻叶千里光中生物碱的提取及测定分析[J].食品科学，2009，30(18)：261-266.