葛力萁，李承宗，程明月，张超群，王志荣

探讨白藜三醇抑制快速电刺激乳鼠心肌细胞氧化应激损伤及其机制

葛力萁，李承宗，程明月，张超群，王志荣

目的：探讨白藜三醇（Resveratrol，RSV）对快速刺激乳鼠心肌细胞氧化应激损伤的保护机制。

方法：本实验采用胰酶和胶原酶双酶法及差速贴壁法分离新生大鼠心肌细胞和成纤维细胞。心肌细胞随机分为5组：空白对照组、快速电刺激组（RES组）、快速电刺激+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶抑制剂夹竹桃麻素组（RES+APO组）、快速电刺激+白藜三醇组（RES+RSV组）、快速电刺激+钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂组（RES+AIP组）。为了证实白藜三醇是否还通过蛋氨酸亚砜还原酶—氧化型钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（MsrA-OXCaMKⅡ）途径对心肌细胞产生保护作用。除了上述5组，另设了MsrA竞争性阻断剂0.5%二甲基亚砜（DMSO）对照组（DMSO对照组）和RSV+DMSO组，RES+RSV+DMSO组。细胞计数Kit-8（CCK-8）法检测心肌细胞活性以确定白藜三醇的最佳浓度，采用酶联免疫吸附检测法（ELISA）检测细胞培养液中AngⅡ水平以选择最佳心肌细胞电刺激时间。流式细胞仪检测心肌细胞内活性氧水平；蛋白免疫印迹法（Western blot）检测心肌细胞MsrA、NADPH氧化酶4（Nox4）、NADPH氧化酶2（Nox2）、NADPH氧化酶p22phox亚基（P22phox）、OX-CaMKⅡ、凋亡相关激酶半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-3剪切蛋白表达。

结果：（1）与空白对照组比，RES组心肌细胞AngⅡ分泌显著增加，同时Nox4、Nox2及P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白的表达水平显著增加。（2）与RES组比，RES+APO组、RES+RSV组和RES+AIP组的活性氧水平降低，RES+RSV组降低更明显。（3）与RES组比较，RES+APO组、RES+RSV组的Nox4、Nox2及P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白的表达水平降低，RES+AIP组仅Nox2、OX-CaMKⅡ及Caspase-3剪切蛋白表达水平降低。（4）加入MsrA抑制剂二甲基亚枫（DMSO）后，白藜三醇抑制快速电刺激导致的Caspase-3剪切蛋白表达作用减弱。

结论：白藜三醇对快速电刺激乳鼠心肌细胞具有保护作用，其机制可能是抑制NADPH氧化酶及增加MsrA表达，从而减少乳鼠心肌细胞氧化应激损伤。

白藜三醇；快速电刺激；乳鼠心肌细胞；NADPH氧化酶；蛋氨酸亚砜还原酶

Methods: The neonatal rats cardiac fibroblasts and myocytes were isolated by double enzyme digestion and differential adhesion method, and the cardiomyocytes were randomly divided into 5 groups: ①Control （CTR） group, ②Rapid electrical stimulation （RES） group, ③RES+APO group, cells were pretreated with NADPH oxidase inhibitor APO, ④RES+RSV group,⑤RES+AIP group, cells were pretreated with CaMKII inhibitor AIP. In order to confirm whether RSV protection was via MsrA-OX-CaMKⅡpathway, the cells were further divided into another 3 groups: ①DMSO control group, ②RSV+DMSO group, ③RES+ RSV+DMSO group. The best dose of RSV was measured with Kit-8 by cardiomyocytes surviving condition, the optimal electrical stimulation time was detected with ELISA by Ang II level in conditioned medium. The level of reactive oxygen species （ROS） in cardiomyocytes was detected by flow cytometry, the protein expressions of MsrA, Nox4, Nox2, P22phox, OX-CaMK II and apoptosis related cleaved caspase-3 were observed by Western blot analysis.

Results:①Compared with CTR group, RES group showed increased AngII secretion with increased protein expressions of Nox4, Nox2, P22phox, OX-CaMK II and cleaved caspase-3. ②Compared with RES group, the RES+APO, RES+RSV, RES+AIP groups had decreased ROS level, the ROS was even lower in RES+RSV group. ③Compared with RES group, the RES+APO, RES+RSV groups presented decreased protein expressions of Nox4, Nox2, P22phox, OXCaMK II and cleaved caspase-3, while RES+AIP group only had decreased Nox2, OX-CaMK II and cleaved caspase-3.④Compared with DMSO control group, RES+ RSV+DMSO group had the lower level of cleaved caspase-3 expression.

Conclusion: RSV has protective effect on rapid electrical stimulation incurred oxidative stress injury in neonatal rats cardiomyocytes, which might be via NADPH oxidase with the increased MsrA expression .

（Chinese Circulation Journal, 2015,30:684.）

氧化反应对机体很重要，对细胞产生潜在的危害。目前对活性氧的具体作用途径和机制并不完全明确，但一般清除活性氧，或是下调过氧化物酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶及一氧化氮解偶联，将对心血管系统产生保护作用[1-4]。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMKⅡ）在心血管病中起到重要作用，活性氧作用的主要靶蛋白之一。是活性氧使CaMKⅡ转换为氧化型钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（OX-CaMKⅡ），呈持续的激活状态。激活的CaMKⅡ将导致心肌细胞离子通道的改变、兴奋收缩偶联异常，促进活性氧继续增加，甚至细胞凋亡。蛋氨酸亚砜还原酶（MsrA）可以逆转CaMKⅡ氧化，减少对心肌细胞的损伤[5]。

白藜三醇（RSV）是广泛存在于植物中的一种活性多酚物质。大量研究表明，RSV具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等生物学特性，发挥心血管保护作用[6]。同时，白藜三醇对Na+、K+离子及钙瞬变产生影响，从而保护心肌细胞[7]。此外，研究表明，白藜三醇可抑制NADPH氧化酶从而对心肌细胞产生保护作用[8]。本研究旨在探讨白藜三醇对快速电刺激心肌细胞氧化应激损伤的保护机制。为证实白藜三醇除了抑制NADPH氧化酶外，是否还通过MsrA-OXCaMKⅡ途径对心肌细胞产生保护作用，我们加入NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃麻素（APO）及CaMKⅡ抑制剂（AIP）与之相比，进一步为研究白藜三醇在心血管疾病方面的治疗作用提供理论依据。

1 材料与方法

药品及试剂：新生SD大鼠来源于徐州医学院动物实验中心，RSV、APO和AIP均购于美国Sigma公司。DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司。细胞刺激仪购于美国拜谱公司。大鼠血管紧张素-Ⅱ（AngⅡ）酶联免疫检测试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司。鼠抗β-肌动蛋白（β-actin）、二氨基联苯胺显色剂（DAB）、碱性磷酸酶标记的马抗小鼠和山羊抗兔二抗均购于北京中杉金桥科技有限公司。细胞计数Kit-8（CCK-8）试剂盒、活性氧检测试剂盒购于碧云天生物技术研究所。NADPH氧化酶4（Nox4）、NADPH氧化酶2（Nox2）、NADPH氧化酶P22phox亚基（P22phox）抗体购于武汉博士德生物公司。MsrA抗体购于美国Abcam公司。OX-CaMKⅡ抗体购于美国Genetex公司。凋亡相关激酶半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）抗体购于美国Santa Cruz公司。

心肌细胞分离培养及鉴定：取新生SD大鼠心脏400只，按照文献[9]的方法获得原代心肌细胞和心肌成纤维细胞。

快速电刺激模型的制备和分组：心肌细胞种于6孔板中，培养至第4天置换为无血清培养基，并予以不同药物处理，NADPH氧化酶抑制剂APO剂量100 μmol/L，AIP的剂量是2 μmol/L。将与6孔板配套的带有刺激电极的盖板覆盖于6孔板上，电极到达培养基液面以下。盖板通过导线连接于刺激器，将刺激器频率设置为4 HZ。心肌细胞分为五组：空白对照组（未给予任何干预）、快速电刺激组（RES组）、RES+APO组、RES+RSV组和RES+AIP组。

为了证实白藜三醇是否还通过MsrA-OXCaMKⅡ途径对心肌细胞产生保护作用。除了上述5组，另设了MsrA竞争性阻断剂0.5%二甲基亚砜（DMSO）对照组（DMSO对照组）、RSV+DMSO组和RES+RSV+DMSO组。

CCK-8检测心肌细胞活性以确定白藜三醇的最佳浓度：白藜三醇分5、10、15、20、25 μmol/L五个浓度，将原代心肌细胞按每孔1×105个细胞接种于96 孔板。实验步骤：避光的条件下每孔加入10 μl的CCK-8溶液，将培养板放在培养箱中预培养（在

37℃，5% CO2的条件下）4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度[10]。

酶联免疫吸附检测法（ELISA）检测细胞培养液中AngⅡ水平：分别取电刺激0.5、1.0、1.5、2.0 h心肌细胞培养液，采用ELISA检测不同时间段培养基中AngⅡ水平，具体方法参考剂量说明书操作。

流式细胞仪检测心肌细胞活性氧水平：细胞干预结束后，各组加入荧光探针CM-H2DCFDA至终浓度为5 μmol/L，37℃、5%CO2培养箱内培养30 min。去除培养基，温磷酸盐酸缓冲液（PBS，含NaCl、Na2HPO4、KCl、KH2PO4，pH=7.35）洗三遍，充分去除未进入细胞的CM-H2DCFDA。消化收集细胞，无血清培养基洗2遍，PBS液重悬，上流式细胞仪检测活性氧，激发光488 nm，发射光525 nm。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就测得细胞内活性氧的水平[11]。

蛋白免疫印迹（Western blot）法检测心肌细胞MsrA、Nox4、Nox2、P22phox、OX-CaMKⅡ、Caspase-3剪切蛋白、Caspase-3的蛋白表达。处理后的细胞用PBS液清洗干净，用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液在冰上裂解30 min，14 000×g离心10 min（4℃），收集上清液。二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度，蛋白高温变性，加样，5%的浓缩胶和10%的分离胶进行跑胶，转膜，含5%牛血清白蛋白（BSA）缓冲液封闭3 h，一抗4℃孵育过夜。PBS液洗3遍，每次5 min，二抗室温孵育1.5 h，缓冲液洗净，显色，扫描。

2 结果

2.1 不同白藜三醇浓度组心肌细胞活性的比较（表1）

CCK-8检测结果显示：与空白对照组相比，白藜三醇25 μmol/L组心肌细胞活性明显降低（P＜0.001），其他4个浓度较空白对照组间的差异无统计学意义（P均＞0.05）；与白藜三醇15 μmol/L组相比，白藜三醇20 μmol/L组心肌细胞活性降低（P＜0.05），白藜三醇25 μmol/L组心肌细胞活性也显著降低（P＜0.001）。因此白藜三醇作用于心肌细胞的最佳浓度设定为15 μmol/L。

表1 不同白藜三醇浓度组心肌细胞活性的比较

表1 不同白藜三醇浓度组心肌细胞活性的比较

注：与空白对照组相比***P＜0.001；与白藜三醇15 μmol/L组相比△P＜0.05△△△P＜0.001

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2.2 快速电刺激心肌细胞对血管紧张素Ⅱ水平的影响

与0.5 h相比，电刺激1.5 h及2 h 的AngⅡ水平明显增加[（0.256±0.136） vs （0.890±0.099），（0.256±0.136） vs （0.949±0.095）；P均＜0.001]；但在电刺激1.5 h与电刺激2 h AngⅡ水平未见有明显差异[（0.890±0.099） vs （0.949±0.095），P均＞0.05]，因此，我们选择刺激心肌细胞时间为1.5 h。

2.3 5组心肌细胞内活性氧水平比较（图1）

与空白对照组相比，RES组、RES+APO组及RES+AIP组可见心肌细胞内活性氧水平增高（P均＜0.05），但RES+RSV组心肌细胞内活性氧水平未见有明显差异（P＞0.05）；与RES组相比，RES+APO组、RES+RSV组、RES+AIP组心肌细胞内活性氧产生减少（P均＜0.01）；RES+RSV组活性氧水平低于RES+AIP组（P＜0.05），可见AIP减少活性氧水平的作用较RSV弱；RES+RSV组与RES+APO组活性氧水平未见明显差异（P＞0.05）。这说明RSV减少活性氧水平的作用较APO和AIP强。

图1 5组心肌细胞内活性氧水平的比较（x±s，n=5）

2.4 5组心肌细胞内Nox4、Nox2、P22phox、OXCaMKⅡ蛋白表达的比较（图2）

图2 5组心肌细胞内Nox4、Nox2、P22phox、OX-CaMKⅡ蛋白水平的比较（

与空白对照组相比，RES组Nox4、Nox2、P22phox及OX-CaMKⅡ蛋白表达水平增加（P均＜0.05）。与RES组相比，RES+APO组和RES+RSV组的Nox4、Nox2、P22phox蛋白表达水平均下降（P均＜0.05），但两组间上述三个指标的差异无统计学意义（P＞0.05）。与RES组相比，RES+AIP组只有Nox2、OX-CaMKⅡ蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；此外，RES+RSV组OX-CaMKⅡ蛋白表达水平低于RES+APO组（P＜0.05），但与RES+AIP组的OX-CaMKⅡ蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 5组心肌细胞通过上调MsrA对Caspase-3剪切蛋白和总Caspase-3蛋白表达的影响（图3）

与空白对照组相比，RES组及RES+RSV+DMSO组的Caspase-3剪切蛋白表达增加（P＜0.01）、总Caspase-3蛋白表达减少；与RES组相比，RES+APO组、RES+RSV组、RES+AIP组、DMSO对照组、RSV+DMSO组的Caspase-3剪切蛋白表达均减少（P＜0.05）、总Caspase-3蛋白表达增加；与RES+RSV+DMSO组比较，RES+RSV组、DMSO对照组、RSV+DMSO组的Caspase-3剪切蛋白表达减少（P＜0.01）、总Caspase-3蛋白表达增加，但RES+APO组、RES+AIP组的Caspase-3剪切蛋白表达水平与RES+RSV+DMSO组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 白藜三醇通过上调MsrA对Caspase-3剪切蛋白和总Caspase-3蛋白表达的影响（

3 讨论

本实验发现，短暂的快速电刺激将导致心肌细胞内AngⅡ增加，同时也伴随着NADPH氧化酶和活性氧增加，最终导致Caspase-3蛋白表达增加。本实验中，我们发现白藜三醇可以抑制快速电刺激导致的心肌细胞Caspase-3剪切增加，其机制可能是通过抑制NADPH氧化酶及增加MsrA表达从而发

挥对心肌的保护作用。

越来越多的证据表明，活性氧的增加将会导致心血管疾病的发生，如冠状动脉粥样硬化、高血压、心律失常、心力衰竭等[2-4]。大量研究证实，AngⅡ是导致活性氧产生的主要因素[12]。CaMKⅡ属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族, 活性氧作用的主要靶蛋白之一。 CaMKⅡ的增加或活性的提高将导致钙离子平衡失调和活性氧继续增加，导致心力衰竭[13]。CaMKⅡ也存在Ca2+/CaM非依赖性激活，包括磷酸化激活和氧化激活。活性氧诱导的氧化反应使CaMKⅡ调节域的甲硫氨酸残基Met28l/282氧化，转变成OX-CaMKⅡ，CaMKⅡ呈现持续激活状态。CaMKⅡ的氧化主要是通过NADPH氧化酶和线粒体产生的活性氧，NADPH氧化酶通路的基因敲除或是活性氧的清除将减少CaMKⅡ的氧化[14]。MsrA也将使OX-CaMKⅡ可逆，从而减少对心肌的损害和心脏重构[15]。

白藜三醇是一种自然的酚类化合物。白藜三醇主要调节脂肪细胞、成纤维细胞生物学、血小板活性、血管功能、氧化应激、炎症等对心血管产生保护[16]。其中，抗氧化应激主要是通过抑制NADPH氧化酶、增加沉默信息调节因子2相关酶1（SIRT1）/叉形头转录因子O亚家族（FOXO）及核因子E2相关因子2（Nrf2）依赖性转录从而减少活性氧产生[17]。

心率的增加将使单位时间收缩的次数增加，从而影响细胞间隙，最终影响传导速度[18]。本实验发现快速电刺激使单位时间收缩的次数增加，致AngⅡ增加和活性氧的增加，从而导致心肌细胞的凋亡。白藜三醇可以抑制NADPH氧化酶和增加活性氧的清除能力，对心肌损伤产生保护。为进一步研究白藜三醇的作用机制，我们加用NADPH氧化酶抑制剂和CaMKⅡ抑制剂组。RES+RSV组及RES+APO组可明显降低Nox4、Nox2、P22phox蛋白表达，但RES+AIP组未见有明显抑制作用。流式细胞检测提示RES+RSV组较RES+APO组和RES+AIP组活性氧有明显降低，提示白藜三醇不仅仅通过抑制NADPH氧化酶减少活性氧产生，还存在其他途径减少活性氧。白藜三醇可增加MsrA，从而抑制OX-CaMKⅡ，减少活性氧的继续产生，减少Caspase-3剪切蛋白表达，但在加入MsrA抑制剂时，白藜三醇对抑制心肌Caspase-3剪切蛋白表达作用消失。白藜三醇通过抑制NADPH氧化酶及增加MsrA蛋白表达，最终使Caspase-3剪切蛋白表达减少，抑制氧化应激对心肌细胞损伤。

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Resvertrol Suppressing the Rapid Electrical Stimulation Incurred Oxidative Stress Injury in Neonatal Rats Cardiomyocytes With its Possible Mechanisms

GE Li-qi, LI Cheng-zong, CHENG Ming-yue, ZHANG Chao-qun, WANG Zhi-rong.
Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou （ 221000）, Jiangsu, China

Objective: To explore the protective mechanism of resvertrol （RSV） suppressing the rapid electrical stimulation incurred oxidative stress injury in neonatal rats cardiomyocytes.

Resvertrol; Rapid electrical stimulation; Neonatal rats cardiomyocytes; NADPH oxidase; MsrA

2014-11-26）

（编辑：许 菁）

221000 江苏省徐州市，徐州医学院附属医院 心内科

葛力萁 硕士研究生 主要从事心律失常防治的基础与临床研究 Email：woshigeliqi@163.com 通讯作者：王志荣 Email: xzzrw@163.com

R54

A

1000-3614（2015）07-0684-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.07.017