章亚兵，汪 宁

(1.安徽中医药大学，安徽合肥 230031;2.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 210051)

通过体外药理实验研究中药及复方制剂药理作用，由于中药成分的复杂性［1］，体外实验对培养体系的干扰因素大，易受到中药中的渗透压、pH、鞣酸及离子等成分的干扰，影响到了实验结果的准确性。日本学田代真一提出了中药血清药理学方法的概念［2］，中药血清药理学是指将中药或中药复方经口给动物灌服一定时间后采集动物血液，分离血清，用含有药成分的血清进行体外实验的一种实验技术。作为一种改良的中药体外实验方法，中药血清药理学研究排除了中药粗制剂直接加入反应系统所带来的干扰，有利于发现体外没有作用而体内有作用的药物，相对真实地反映药物的整体作用［3］。但是机体在服用一定剂量的某种药物后，药物的成分或代谢产物经过血液循环到达其作用的靶器官，而最终与靶器官的细胞上的作用靶点直接接触的并不是含药血清，而是含有一定浓度活性成分的组织液［4］。在机体产生的组织液中，脑脊液是常见的也是一种十分重要的组织液。但是由于血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)作用，使得脑脊液的成分与血清的成分，不论是生理性还是药物(代谢)成分都存在差异。血脑屏障是存在于脑组织和血液之间的一个复杂的细胞系统，控制血脑两侧的物质转运，从而保证中枢神经组织内环境的稳定［5］。BBB受损是脑血管疾病发生、发展的主要原因之一［6］。可通过代谢进入血清的中枢神经药物有效成分因受BBB的选择性通过作用是否能够达到脑脊液中，发挥中枢神经保护作用，是研究者们对中药复方进行药效学研究时面临的难题。近来有学者提出用含药脑脊液通过体外实验用于研究中枢神经系统药物的药理作用。以中药复方的含药脑脊液来代替含药血清通过体外实验研究中药的药理作用及确定中药的有效成分将可能缩小研究范围，突出重点，并可避免血清中复杂成分的干扰，更能体现有效成分的药理作用，增加有效成分研究的针对性［7－10］。

1 脑脊液药理学方法的提出

中药脑脊液药理学是实验动物给予一定剂量的中药后，通过采集动物含药脑脊液作为受试药进行药理研究的实验方法。脑脊液是存在于各脑室、蛛网膜下腔和脊髓中央管内的无色透明液体，由脑部特殊的毛细血管网产生。而血脑屏障是存在于脑部的血浆与脑细胞之间的屏障，其中存在着紧密连接蛋白等特殊生物学结构，仅仅分子质量较小的脂溶性物质及气体分子才能顺利通过进入脑脊液。其他化学物质，即使是对脑组织有治疗作用的药物也有可能被认为是对大脑内部环境产生不利影响而阻挡在BBB以外，这样才能保证维持大脑内生理环境相对稳定和中枢神经系统的正常结构与功能［11－13］。BBB对于脑部正常的生理活动起着至关重要的作用，但是由于其同时能够阻止药物自由进入脑组织，也增加了对中枢神经系统(CNS)疾病的治疗难度，对于新药筛选和药理药效的保护作用及其机制的阐述同样增加了难度。鉴于此，在对新药筛选和药理药效的保护作用及其机制的阐述时，中药的有效成分是否能够通过BBB作用于脑部神经细胞发挥药理作用是我们实验的关键。梅建勋等［14］提出中药脑脊液药理学的实验方法，并研究了这一方法对星形胶质细胞的离体作用。在家兔灌胃给予中药后，采集脑脊液并作用于正常星形胶质细胞后发现，正常星形胶质细胞在含脑脊液培养基中培养状态明显优于含相同浓度血清培养基［15］，表明中药脑脊液方法优于血清药理学方法，并使用此方法研究了脑益智方的含药脑脊液对神经元细胞的保护作用［16］。

2 中药脑脊液药理学的现状

2.1 中药脑脊液药理学的应用 在具体试验时，如何造模以及细胞损伤指标的选择是学者们根据研究对象的不同而具体选择，一般通过采集含药脑脊液后作用于经过加入化学物质如谷氨酸［17］、KCl［18］、过氧化氢［19］、连二亚硫酸钠［20］等进行造模的细胞株，通过考察细胞的各类指标研究其保护作用及作用机制。选择合适的化学物质造模后，细胞的各项指标如膜通透性［21］、氧化应激水平［22］、能量代谢［23］、钙超载程度［24］、各类基因、蛋白的表达均会发生变化［25］，通过对这些指标的检测可确认含药脑脊液是否有保护作用，以及通过一系列指标的测定找出其作用靶点。在膜通透性检测方面，可使用AO/EB染色，台盼兰染色，培养上清液中LDH浓度等指标进行试验;在衡量细胞氧化应激水平方面，NO浓度、SOD活性、MDA浓度、ROS浓度均是常用参数;在能量代谢水平方面，ATP酶活性检测、罗丹明123染色利用流式细胞术分析等试验是良好的方法;在钙超载程度衡量时可使用细胞内游离钙离子浓度检测，Westen-blotting方法检测钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)比值衡量磷酸化程度等方法。在凋亡蛋白表达方面，c-fos和c-jun、凋亡基因bax、bcl-2 和 caspase-3 均是不错的选择［26－30］。由于脑脊液是体内重要的神经营养液，通过给药后可从下列方面说明可应用于药效学的研究。首先，含药脑脊液中可能含有效应物质，可应用于中枢神经系统药物的体外药效学研究。叶光华等［31］证明了清心开窍方含药脑脊液对αβ25-35损伤的PC12细胞具有保护作用。李福东等［32］发现PC12细胞在开心散含药脑脊液无血清培养基中也能够生长，并且具有含药脑脊液浓度相关性。开心散复方中的有效成分能够经过吸收、转化并通过BBB进入脑部发挥药效。张晓艳等［33］通过研究发现，清心开窍方含药脑脊液能够明显提高KCL所致损伤的PC12细胞活力，在AD的治疗效果是显著的。上述研究成果从不不同方面说明了含药脑脊液可改善损伤细胞的保护作用，为临床用药提供了依据，为保护机制的研究奠定了基础。其次，含药脑脊液中新化学物质研究可阐述中药复方的物质基础。孙志翠等［34］在相同色谱条件下比较了各组的HPLC指纹图谱，初步鉴定出了脑脊液成分、复方成分以及代谢产物，证实了给药后脑脊液中出现了复方中的有效成分。李越峰等［35］利用HPLC法比较大鼠给药后血中以及脑脊液中的移行成分，确认了复方中的有效成分为辛弗林、芍药苷、柴胡皂苷C及甘草次酸的混合物。汪宁等［36］通过研究通窍活血颗粒家兔灌胃后利用气相色谱法研究脑脊液移行成分，并且发现了通窍活血颗粒复方制剂中君药麝香所含成分麝香酮，并提出可定量测定其含量以此作为复方制剂质量标准之一。上述研究表明，含药脑脊液的药效学结果均有物质基础依据，是药效学的重要佐证。另外，脑脊液的成分变化引起脑内其他生物活性物质变化也是研究的热点。谢宁等［37－38］通过灌胃方式给予家兔地黄饮子水提取物后抽取家兔脑脊液并用来研究了含药脑脊液对β-淀粉样蛋白(αβ25-35)所致PC12损伤细胞即早基因c-fos和cjun、凋亡基因bax、bcl-2和caspase-3表达作用的影响。结果显示 c-fos、c-jun、bax和 caspase-3表达被抑制，只有bcl-2的表达是提高的，含药脑脊液可通过引起脑内基因的表达影响神经细胞的生长。

2.2 中药脑脊液药理学的关键实验步骤

2.2.1 实验动物选择 大小鼠、家兔、犬是我们常用的实验动物。邹永杰在对Longa法加以改良，建立小鼠的线栓法永久性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型，深入研究了高压氧预适应对小鼠MCAO模型的脑缺血保护作用［39］。池欣欣用大鼠进行了缺血再灌注大鼠脑损伤的实验研究［40］。大鼠由于价格低廉、饲养费用低、脑血管解剖结构与高等动物相似、生态学和伦理学等因素考虑［41］，是实验者常选择的实验动物之一。刘聪等通过新西兰兔灌胃柴黄颗粒后取脑脊液研究了脑脊液中发热介质的影响［42］。家兔可取得脑脊液量远大于大小鼠，虽然费用较之稍高，为保持理化、生物特性的一致性，可减少因种群差异产生的免疫反应，提高实验结果可信度，也是实验者常用的实验动物。张升等建立一种新的手术模型，实现对脑脊液(CSF)的多次采集，动物手术存活率为80%，模型成功率为60%［43］，有利于多次累积采集脑脊液，适合用于对脑脊液需求量大的实验。马锋等利用六味地黄丸兔、大鼠、人3种不同种属动物含药脑脊液脑脊液对αβ1-40诱导的细胞活力减低有明显抑制作用，且未发现差异性［44］，提示种群差异不是我们动物选择的唯一标准。

2.2.2 脑脊液采集 动物的脑脊液体积很少，实验者应根据自身能力及特点，尽量采取熟练的、可行的获取方法。杨子等［45］进行了3种采集方法的比较，以选择可靠的采集方法。第一，经皮穿刺延髓池抽取脑脊液。本方法虽然操作简单，但是难度太大，未能成功采集合格脑脊液，其原因是采集者不能不能确保进针位置的绝对准确，且不能保证进针深度合适，容易刺穿延髓池。第二，直视下划破硬脊膜抽取脑脊液。本方法10只大鼠均能采集到清凉脑脊液，但离心后出现8例血性脑脊液，合格率为20%。究其原因，在用手术刀片划破硬脊膜时极易划破组织血管，导致采集失败，且待脑脊液流出后再用微量注射器采集，在流出和采集的间隔极易被污染。第三，直视下经硬脊膜穿刺微量进样器抽取脑脊液。本方法100%采集到清凉合格的脑脊液，且每只能采集超过100 μL。本方法能够成功采集足量脑脊液的原因为，在直视下采集者可用微量注射器直接刺入枕大孔采集，不易产生偏差，且脑脊液未流出之前不与外界接触，不容易产生污染，加之脑脊液只会流向微量注射器，不会产生损失。马伟等［46］采取了直视下经硬脊膜穿刺微量进样器抽取脑脊液的方法，通过枕大孔共抽取了30只SD大白鼠，3只未取出，5只因出现混血失败，其余22只均成功抽出，平均76 μL，成功率为73%，并且其中有18只脑脊液超过100 μL。另通过枕大孔取了50只家兔，其中2例未取出，4例出现混血失败，其余均成功采集，平均700 μL，成功率88%。上述结果表明两组实验者采取的直视下经硬脊膜穿刺微量进样器抽取脑脊液的方法可行，一组采集者成功率略低的原因可能在于采集手法及熟练程度存在差异，并不表明采集方法不可靠，本方法为目前采集者的首选方法。

2.2.3 脑脊液的保存 脑脊液离体后，可立即实验，或者短期－20℃保存，一般不超过30 d，以防变性。夏吉荣等［47］通过比较脑脊液和血清中共同含有的化学物质神经元特异性烯醇化酶(NSE)，发现在相同温度下脑脊液中的NSE稳定性较差，说明脑脊液对离体后的化学物质保护作用更差。另外发现脑脊液中的NSE测定值比文献中的测定值低，可能是实验后放置的时间过长导致NSE分解。通过以上实验结果，初步表明，标本保存温度、时间可能是NSE稳定性的重要影响因素，这就要求实验者的尽量缩短采集时间，并在采集结束后尽快于－20℃保存。

3 中药脑脊液药理学的总结和展望

中药脑脊液药理学是近年应用于中枢神经疾病与治疗药物研究的热点，其模拟了中药经过加工、给药、吸收、代谢后在脑部的分布情况，为中药及其成方制剂研究提供了良好的离体实验方法，有利于中枢神经系统药物的保护作用、作用机制和药效物质基础研究。随着方法学的进一步完善，其必将适用于更加广泛的研究领域中。

［1］赵 超，李会军，陈 君，等.中药复杂成分解析与质量评价的研究进展［J］.中国药科大学学报，2012，43(3):283 －288.

［2］Htioko I，Sekae A，Yukio O.Effect of shosaikoto，a Japanese and Chinese herbalmedicinal mixture on the mitogenic activity of lipopo2 lysaocharide，a new pharmacological testing method ［J］.J Ethno2 Hpermacol，1987，21:452531.

［3］黄臣虎，陆 茵，高骁君，等.中药血清药理学研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2011，17(10):266 －271.

［4］王喜军，张 宁.六味地黄丸的血清药物化学研究［J］.中国天然药物，2004，2(4):219 －222.

［5］廖华宁，汪 宁，王 艳.紧密连接蛋白与血脑屏障［J］.安徽医药，2012，16(3):377 －379.

［6］张春丽，孟 强.缺血性脑血管病血脑屏障研究进展［J］.医学综述，2013，19(11):1935 －1937.

［7］胡海燕，席东泽，雷 磊，等.清心开窍方含药脑脊液对谷氨酸致PC12细胞损伤的保护机制［J］.中国中药杂志，2013，38(12):1997－2000.

［8］秦秀德，刘 玉，张玉莲，等.清脑益智方含药脑脊液对缺氧复氧皮层神经元细胞重塑相关指标的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(10):174 －177.

［9］李福东，王艳华，张 超，等.开心散含药脑脊液对无血清培养PC12细胞的促生长作用［J］.中医药学报，2012，40(6):12 －14.

［10］何秀丽，孟 菲，周妍妍，等.地黄饮子含药脑脊液对受损PC12细胞β-淀粉样前体蛋白mRNA表达的干预［J］.中医药信息，2011，28(4):26 －28.

［11］Deeken JF，Loscher W.The blood-brain barrier and cancer:transporters，treatment and Trojan horses［J］.Clin Cancer Res，2007，13(6):1663－1674.

［12］Hawkins BT，Davis TP.The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disese［J］.Pharmacol Rev，2005，57(2):173 －185.

［13］Ballabh P，Braun A，Nedergaar DM，et al.The bloodbrain barrier:an overview:structure，regulation，and clinical implications［J］.Neurobiol Dis，2004，16(1):1 －13.

［14］梅建勋，张伯礼，陆 融.中药脑脊液药理学研究方法的初建:对中药影响的星形胶质细胞神经营养作用的观察［J］.中草药，2000，31(7):523 －526.

［15］梅建勋，张伯礼.中药脑脊液保护神经元损伤的离体实验研究［J］.天津中医，2000，17(5):36 －38.

［16］梅建勋，张伯礼.采用脑脊液药理学方法对中药影响星形胶质细胞神经营养作用的观察［J］.中药材，2000，23(8):467－469.

［17］汪 宁，邓 奕，朱 荃，等.通窍活血汤含药所致PC12细胞损伤的保护作用［J］.中华中医药学刊，2010，31(3):1307－1310.

［18］王 俊.六味地黄丸对KCl诱导PC12细胞钙超载损伤的保护作用池欣欣［D］.沈阳:辽宁中医药大学，2013.

［19］朱未名，胡海燕，陈 翔，等.清心开窍方含药脑脊液对过氧化氢(H2O2)所致PC12细胞损伤的保护作用［J］.中华中医药学刊，2013，31(3):466 －469.

［20］胡海燕，崔志慧，陈 翔，等.清心开窍方含药脑脊液对连二亚硫酸钠所致PC12细胞损伤的保护机制研究［J］.中国中药杂志，2013，38(9):1314 －1317.

［21］杨丽娜，头部前低温对全脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体通透性转换孔及细胞凋亡的影响［D］.石家庄:河北医科大学，2014.

［22］杨静静，赵启韬.中药抑制心血管系统氧化应激的活性成分及其机制［J］.辽宁中医药大学学报，2014，15(5):104 －106.

［23］余福林，李红梅，高 延，等.缺血/再灌注损伤后心肌细胞线粒体功能及其能量代谢变化［J］.西北国防医学杂志，2013，34(2):113－115.

［24］孙 洲，龚 瑜，孙圣刚，等.钙超载对 PC12细胞活性及 p-CREB 表达的影响［J］.武汉大学学报(医学版)，2011，32(3):384－386.

［25］姚 娟，马慧萍，杨 燕，等.缺氧环境对 PC12细胞损伤及HIF-1 mRNA表达水平的影响［J］.中国药理学通报，2011，27(2):162－166.

［26］刘瑞珍，郭春钰，曾 靖，等.3’－大豆苷元磺酸钠对谷氨酸引起的PC12细胞损伤的保护作用［J］.赣南医学院学报，2014，34(2):161－164.

［27］陶美皊.dFGEM对谷氨酸诱导的PC12细胞损伤的保护作用研究［D］.长沙:湖南师范大学，2012.

［28］王 佳，高 峰，张春兵，等.川芎嗪对咖啡因引起的PC12细胞损伤的保护作用［J］.医药导报，2014，33(6):695 －698.

［29］张 明，荔志云，赵红斌，等.大黄素甲醚对神经细胞缺氧性损伤保护作用的实验研究［J］西北国防医学杂志，2012，33(2):106－110.

［30］宋明洁，戴雪伶，常 平，等.Zn2+对αβ1－40诱导PC12细胞损伤的保护作用［J］.生命科学研究，2013，17(4):331 －336.

［31］叶光华，胡海燕，陈 翔，等.清心开窍方含药脑脊液对αβ25－35所致PC12细胞损伤的保护作用［J］.中国中药杂志，2012，37(21):3271 －3274.

［32］李福东，王艳华，张 超，等.开心散含药脑脊液对无血清培养PC12细胞的促生长作用［J］.中医药学报，2012，40(6):12－14.

［33］张晓艳，胡海燕，陈 翔，等.清心开窍方含药脑脊液对氯化钾所致PC12细胞损伤的保护机制［J］.中国老年学杂志，2014，5(34):2477－2479.

［34］孙志翠，刘西建，郭 炜，等.酸枣仁汤含药脑脊液指纹图谱研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(24):171 －173.

［35］李越峰，苏云明，李延丽，等.四逆散镇静催眠作用的物质基础初步研究［J］.中草药，2012，43(7):1361 －1365.

［36］汪 宁，常国洁，晋齐中，等.通窍活血颗粒灌胃家兔后体内血清及脑脊液中麝香酮的分析［J］.中药材，2012，35(8):1291－1294.

［37］谢 宁，孟 菲，姚辛敏，等.地黄饮子含药脑脊液对Aβ25 －35诱导PC12细胞损伤即早基因c-fos和c-jun表达的影响［J］.时珍国医国药，2007，18(22):2875 －2877.

［38］谢 宁，姚辛敏，孟 菲，等.地黄饮子含药脑脊液对Aβ25－35诱导的PC12细胞损伤凋亡基因bax bcl-2和caspase-3表达的影响［J］.中华中医药学刊，2007，25(9):1770 －1773.

［39］邹永杰.高压氧预适应对小鼠永久性大脑中动脉闭塞模型的保护作用研究［D］.重庆:第三军医大学，2013.

［40］池欣欣.中药与骨髓源干细胞联合治疗缺血再灌脑损伤大鼠的实验研究［D］.沈阳:辽宁中医药大学，2013.

［41］Ginsberg MD，Busto R.Rodent models of cerebral ischemia［J］.Stroke，1989，20(12):1627－1642.

［42］刘 聪，杨 林，方 芳，等.柴黄颗粒对内毒素致热新西兰兔脑脊液中发热介质的影响［J］.儿科药学杂志，2012，18(5):13－16.

［43］张 升，辛艳飞，顾利强，等.Beagle犬脑脊液(CSF)多次采集手术模型的建立［J］.实验动物科学，2011，28(5):69－71.

［44］马 锋，田建英.六味地黄丸含药脑脊液神经保护作用的实验研究［J］.宁夏医学杂志，2006，28(3):165 －167.

［45］杨 子，赖关朝，王国彬，等.SD大鼠脑脊液采集方法改进［J］.中国职业医学，2011，38(2):117 －119.

［46］马 伟，马 锋，田建英.一种简单实用的实验动物中药脑脊液采集方法［J］.宁夏医学院学报，2007，29(4):436 －437.

［47］夏吉荣，伯孝华，黄天禄，等.脑脊液保存条件对神经元特异性烯醇化酶测定结果的影响分析［J］.陕西医学检验，1996，11(4):34－35.