何慧怡，樊丽娜，齐永文，劳方业，邓海华

(广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州 510316)

草铵膦在甘蔗愈伤分化阶段和刚成苗阶段筛选浓度的确定

何慧怡，樊丽娜，齐永文*，劳方业，邓海华

(广州甘蔗糖业研究所 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州 510316)

本试验以甘蔗品种ROC22和粤糖93-159的愈伤组织和刚分化4周小苗为试验材料，初步确定了草铵膦在愈伤组织分化阶段和刚分化4周小苗阶段的筛选浓度。综合试验结果，适合草铵膦在ROC22和粤糖93-159愈伤组织分化阶段的筛选浓度为2.5 µmol/L；适合草铵膦对ROC22刚分化4周小苗的筛选浓度为5.5 µmol/L，适合草铵膦对粤糖93-159刚分化4周小苗的筛选浓度为6.6 µmol/L。

草铵膦；甘蔗；筛选浓度

0 引言

甘蔗是重要的糖料作物，也是制糖工业的重要支柱[1]。采用化学除草剂防治蔗园杂草来代替人工及机械除草，是一项已在世界上广泛应用的技术。它具有防治成本低、节省工时、减轻劳动强度、能及时有效地防除杂草、保证蔗株正常生长而获高产的优点[2-3]。但化学除草剂若使用不当，则会造成药害，使甘蔗不能正常生长而导致减产。因此生产上对具有抗除草剂抗性的甘蔗品种需求越来越大。

草铵膦(Glufosinate-Ammonium)是德国赫斯特

公司创制的有机磷类非传导灭生性除草剂，具有活性高、低毒、环境兼容性好等特点。目前，对草铵膦具有抗性的作物基本上都是通过转基因的方法获得的[4-6]。在甘蔗育种方面，与其他作物相似，Bar基因常被作为目的基因的选择标记而转入甘蔗体内，从而使得这些转基因甘蔗具有目的性状的同时也具有对草铵膦的抗性[7-10]。近年来除了转基因育种外，还出现了诱变育种等新育种方法[11-13]，通过新育种方法选育具除草剂抗性的甘蔗品种可以缩短育种年限，提高育种效率。因此确定草铵膦在甘蔗组培阶段的筛选浓度，对转基因育种及诱变育种等后期抗性筛选阶段有积极意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘蔗品种ROC22和粤糖93-159的愈伤组织以及这两品种刚分化4周的小苗。

1.2 试验方法

1.2.1 草铵膦在愈伤组织分化阶段筛选浓度的确定

把ROC22和粤糖93-159的愈伤组织接入含有草铵膦0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 µmol/L的愈伤诱导培养基里，对照组不加草铵膦。4周后调查愈伤组织的转绿率和愈伤成苗率情况。转绿率为长出绿点或分化出小苗的愈伤组织的块数与接种的愈伤组织总块数的百分比。愈伤成苗率为分化出小苗的愈伤组织块数与接种的愈伤组织总块数的百分比。

1.2.2 草铵膦在刚分化4周小苗阶段筛选浓度的确定

把ROC22和粤糖93-159刚分化4周的小苗接入含有草铵膦1.0、2.5、4.0、5.0和7.5 µmol/L的小苗增殖培养基里，对照组不加草铵膦。4周后调查草铵膦对分化小苗的的致死率和苗的生长情况。

2 结果与分析

2.1 愈伤组织在不同浓度草铵膦中的转绿率

ROC22和粤糖93-159的愈伤组织在不同浓度草铵膦中培养4周后的转绿率见图1和图2。从图1和图2可以看出，2个基因型甘蔗的愈伤组织转绿率都随着草铵膦浓度的升高而下降，粤糖93-159愈伤组织分化时对草铵膦的耐受浓度稍高于ROC22。

图1 ROC22愈伤组织在不同草铵膦浓度中的转绿率

2.2 愈伤组织在不同浓度草铵膦中的成苗情况

ROC22和粤糖93-159的愈伤组织在不同浓度的草铵膦中培养4周后的成苗情况见表1、图3和图4。

图2 粤糖93-159愈伤组织在不同草铵膦浓度中的转绿率

表1 愈伤组织在不同浓度草铵膦中的成苗情况

2个基因型甘蔗愈伤组织的成苗率随着草铵膦浓度的提高而下降，且分化的成苗情况也随之转差。当草铵膦浓度为2.5 µmol/L时，愈伤组织虽然能部分分化出苗，但是苗的长势很差，苗姿不正常，苗矮小，且叶片短小卷曲。

图3 ROC22愈伤组织在不同草铵膦浓度中分化培养4周后的生长情况

图4 粤糖93-159愈伤组织在不同草铵膦浓度中分化培养4周后的生长情况

2.3 刚分化4周小苗在不同浓度草铵膦中的致死率及生长情况

ROC22和粤糖93-159刚分化4周小苗在不同浓度草铵膦中培养4周后的致死率见图5和图6。草铵膦对2个基因型甘蔗刚分化小苗的致死率都随着草铵膦浓度的升高而升高。根据趋势线推算，草铵膦对ROC22刚分化小苗的LD50为5.5 µmol/L，对粤糖93-159刚分化小苗的LD50为6.6 µmol/L。

图5 ROC22刚分化4周小苗在不同浓度草铵膦中的致死率

图6 粤糖93-159刚分化4周小苗在不同浓度 草铵膦中的致死率

ROC22和粤糖93-159刚分化4周小苗在不同浓度草铵膦中培养4周后的生长情况见图7和图8。随着草铵膦浓度的升高，小苗的生长情况均受到不良影响，2个基因型甘蔗之间差异不大，苗变矮小，分蘖减少，叶片变短小，叶色变浅、枯黄。当草铵膦浓度为7.5 µmol/L时，大部分小苗已枯黄死亡，存活的小苗也基本没有生长，叶片短小并有褐斑。

图7 ROC22刚分化4周小苗在不同浓度草铵膦中分化培养4周后的生长情况

3 结论

ROC22和粤糖93-159的愈伤组织转绿率都随着草铵膦浓度的升高而下降，这说明除草剂对愈伤组织的分化有负影响。不同基因型甘蔗的愈伤组织对除草剂的耐受浓度稍有差异。在本次试验中草铵膦浓度为2.5 µmol/L时，2个甘蔗基因型愈伤组织的转绿率均大于50%，从成苗的情况看，有很多愈伤组织虽然能转绿，但随着除草剂浓度的增加所成

苗的数量和质量都呈现下降趋势，部分愈伤组织只转绿而不能分化成小苗。所以结合成苗情况，适合草铵膦在甘蔗愈伤组织分化阶段的筛选浓度为2.5 µmol/L。

草铵膦对ROC22和粤糖93-159刚分化4周小苗的致死率随着处理浓度的增加而增高。不同基因型甘蔗刚分化的小苗对除草剂的耐受浓度稍有差异。在本试验中根据趋势线推算，草铵膦对ROC22刚分化小苗的LD50为5.5 µmol/L，对粤糖93-159刚分化小苗的LD50为6.6 µmol/L。从小苗的生长状况看，当草铵膦浓度为5 µmol/L时存活的小苗矮小，叶片短小发黄，当草铵膦为7.5 µmol/L时，大部分小苗已枯黄死亡，存活的小苗也基本没有生长，且叶片短小并有褐斑。因此结合小苗的生长状况，对刚分化的小苗适合ROC22筛选的草铵膦浓度为5.5 µmol/L，适合粤糖93-159筛选的草铵膦浓度为6.6 µmol/L。

图8 粤糖93-159刚分化4周小苗在不同浓度草铵膦中分化培养4周后的生长情况

4 讨论

本试验初步确立了ROC22和粤糖93-159愈伤组织分化阶段和刚分化4周小苗的草铵膦筛选浓度，为日后的诱变育种、转基因育种等后期抗性筛选阶段提供参考。但同时不同基因型甘蔗品种的愈伤组织和刚分化小苗对草铵膦的耐受浓度均有差异，因此日后还需针对试验的甘蔗品种做相应的筛选浓度试验。

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(本篇责任编校：李金玉)

Studies on the Embryo Germination Medium and Plant Regeneration Medium with the Optimum Concentrations of Glufosinate-Ammonium for Sugarcane

HE Hui-yi, FAN Li-na, QI Yong-wen, LAO Fang-ye, DENG Hai-hua
(Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316)

In vitro glufosinate-ammonium selection regimes were respectively used to screen plants regeneration from callus and regenerated shoots (data recorded 4w after embryogenic callus were transferred to embryo germination medium) of ROC22 and YT93-159 for glufosinate-ammonium tolerance in this study. The highseverity treatments with high glufosinate-ammonium concentration which resulted in the necrosis of embryo germination or regenerated shoots were different for the different sugarcane cultivars. In conclusion, when the selection of herbicide-tolerant cell lines of sugarcane was applied to embryogenic callus, incorporating 2.5 µmol/L glufosinate-ammonium into culture medium of embryo germination from callus of the two cultivars was the optimum. When the selection of herbicide-tolerant cell lines of sugarcane was applied to shoot regeneration, incorporating 5.5 µmol/L glufosinate-ammonium into culture medium of regenerated shoots of ROC22 was the optimum, and incorporating 6.6 µmol/L glufosinate-ammonium into culture medium of regenerated shoots of YT93-159 was the optimum.

Glufosinate-ammonium; Sugarcane; Concentration

S566.1

A

1005-9695(2015)01-0005-06

2014-11-25；

2015-01-13

本研究由广东省科技计划（2012A090300015; 2012B020301008; 2012A061400005）共同资助

何慧怡(1981-)，女，农艺师，主要研究方向：甘蔗遗传育种；E-mial：emil06@126.com

*通讯作者：齐永文(1978-)，男，博士，高级农艺师，主要研究方向：甘蔗遗传育种；E-mail：yongwen2001@163.com

何慧怡，樊丽娜，齐永文，等. 草铵膦在甘蔗愈伤分化阶段和刚成苗阶段筛选浓度的确定[J]. 甘蔗糖业，2015(1)：5-10.