郭雪玲(综述)，刘辉国(审校)

(华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科，武汉 430030)



Toll样受体在介导结核分枝杆菌感染免疫反应中的作用

郭雪玲△(综述)，刘辉国※(审校)

(华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸与危重症医学科，武汉 430030)

结核分枝杆菌是结核病的致病菌，机体免疫反应在结核菌的防御和致病中发挥关键调控作用。模式识别受体家族中的Toll样受体(TLRs)能感知结核杆菌感染，并参与调控天然免疫和获得性免疫应答；而TLRs亦能介导结核分枝杆菌的免疫逃避机制过程，促进慢性感染的发生、发展。利用免疫佐剂调控TLRs的功能水平可能有助于增强机体抗结核反应，并有望成为结核病预防和治疗的方向。

结核分枝杆菌；Toll样受体；天然免疫；获得性免疫；免疫逃避

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)属于模式识别受体家族，广泛表达于巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞的细胞膜或内吞小体表面，可识别病原体相关分子模式，对外来病原体进行早期识别，启动天然免疫效应机制，促进细胞吞噬及炎性因子和趋化因子的合成和分泌，诱导抗原呈递细胞表面表达共刺激分子，促使T或B细胞向效应T或B细胞分化，继而活化获得性免疫。机体通过天然免疫和获得性免疫系统来防御结核分枝杆菌的入侵，在结核菌感染初期，TLRs作为天然免疫细胞活化的调节剂发挥着重要作用，并且TLRs依赖的细胞反应也对随后发生的细胞免疫特性和程度产生影响；TLRs亦参与调控结核菌免疫逃逸的发生，是导致结核慢性感染的根源所在[1-4]。现就TLRs在介导结核分枝杆菌感染免疫反应中的作用予以综述。

1 TLRs简介

1.1 TLRs家族 Toll蛋白最早是从果蝇体内分离，1997年，Medzhitov等[5]首次在人体中分离出果蝇Toll蛋白的同系物，命名为TLR4。迄今已知哺乳动物的TLRs共有13种，其中有10种表达于人类细胞膜上[6-7]，TLR2、TLR4和TLR9与结核分枝杆菌感染尤为密切[1,8]，TLR8亦可能参与结核菌的感染免疫反应[9]。

1.2 TLRs结构和信号途径 哺乳动物的TLRs为Ⅰ型跨膜蛋白受体，由胞外段、跨膜段及胞内段构成。胞外段为富含亮氨酸的重复基序，参与配体识别；胞外段借助富含半胱氨酸的C端侧翼与跨膜段相连接；胞内段结构较保守，与人类白细胞介素1(interleukin 1,IL-1)受体序列具有高度同源性，亦被称为Toll/IL-1受体同源区(Toll/IL-1 receptor, TIR)，能与胞内多种转接蛋白交互作用以活化下游信号途径。细胞膜上的TLRs主要通过髓样分化因子88(mycloid differentiation factor 88,MyD88)依赖性的和MyD88非依赖性的信号途径以诱导下游基因的表达；除了TLR3外的TLRs均能通过激活MyD88促进其下游信号蛋白，如白细胞介素1受体相关蛋白激酶(IL-1 receptor associated kinases，IRAK)和肿瘤坏死因子受体相关受体6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6)等的活化继而介导核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的早期激活和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)家族蛋白的活化进而诱导炎性介质的合成；而TLR3和TLR4活化后亦可以经MyD88非依赖的、由能诱导干扰素β生成且含有TIR功能域的转接蛋白所介导的信号途径参与NF-κB的延时激活、并促进Ⅰ型干扰素和炎性介质的生成[3-7]。

1.3 TLRs所识别的配体 不同的TLRs识别各自相应的病原体细胞组分[6-7]。巨噬细胞膜表面上的TLR2与TLR1或TLR6所形成异源二聚体(TLR2/TLR1或TLR2/TLR6)能识别的配体有革兰阳性菌的肽聚糖、磷壁酸和脂蛋白，分枝菌属细胞壁上的阿拉伯甘露聚糖脂、脂化甘露聚糖、脂蛋白(相对分子质量为38 000和19 000)、磷脂酰肌醇甘露糖苷、三酰脂蛋白(TLR2/TLR1)和乙酰脂蛋白(TLR2/TLR6)等[10-11]。TLR4识别的配体主要包括革兰阴性菌表面的脂多糖和热激蛋白(60/65)及结核菌相对分子质量为38 000脂蛋白[12-13]。而双链DNA病毒及细菌和病毒DNA中非甲基化的CpG序列是目前已明确的TLR9所能识别的分子模式。TLR2和TLR4在感知病原体的入侵及启动天然免疫后进一步诱发炎性应答中起主导作用[2,4,14]。

2 TLRs介导结核分枝杆菌的天然免疫和获得性免疫应答

2.1 TLRs介导结核菌的天然免疫过程 结核分枝杆菌与宿主细胞之间的相互作用十分复杂，由结核菌感染所促发的免疫反应伴随于结核菌清除和致病的各个环节。天然免疫应答是抵御结核分枝杆菌感染的第一道防线，始于体内免疫细胞膜上模式识别受体，如TLRs、Nod样受体、补充受体、甘露糖受体、CD14受体、清道夫受体、Fcγ受体和树突状细胞特异性细胞间黏附分子等，对结核菌细胞壁上相应病原体相关分子模式的识别。其中，TLRs在结核菌的宿主防御反应中作为连接天然免疫和获得性免疫的“桥梁”，起着关键性的诱导作用[2,8]。

结核菌主要经呼吸道入侵机体。当机体感染结核菌后，位于巨噬细胞和树突状细胞膜上的TLRs特异性地识别结核菌上的病原体相关分子模式(如相对分子质量为19 000和38 000 的脂蛋白、脂化甘露聚糖、磷脂酰肌醇甘露糖苷、阿拉伯甘露聚糖脂和核酸等)，随后激活转接蛋白MyD88募集IRAK、TRAF6、MAPKs和转录生长因子β相关蛋白激酶1等效应分子引起细胞内多条信号通路的活化，联合诱导NF-κB的活化转位入核，继而促使下游多种促炎性因子、趋化因子、黏附分子和受体分子靶基因的转录表达[4,8,15]，其中最为关键性分子是肿瘤坏死因子和干扰素[14]。而IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子参与募集单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等炎性细胞到相应病变部位，诱导单核细胞向巨噬细胞的分化。巨噬细胞膜上的TLRs受配体的激动后能上调诱导型一氧化氮合酶、一氧化氮、活性氧物质和活性氮物质的合成，并促进胞质中吞噬体的酸化及吞噬体和溶酶体融合形成吞噬溶酶体的过程，从而介导巨噬细胞直接杀菌效应的发挥[16-18]。同时，TLR4激活可引起细胞内LRG47合成增加而促使结核菌向自噬体聚集，可见TLRs在联系天然免疫和自噬过程中亦起到一定作用[19-20]。此外，结核菌细胞壁上相对分子质量为19 000 的脂蛋白经TLR2识别而启动受感染的吞噬细胞的凋亡过程，该过程由半胱氨酸蛋白酶8介导[4,11,21-22]。由此说明，TLRs及其相关信号通路在结核菌诱导的天然免疫应答过程起着核心调控作用[2-3]。研究表明，TLR2-/-小鼠无法形成正常的结核肉芽肿，当暴露于高剂量的结核分枝杆菌时其结核病的感染率明显升高，并伴有调控慢性结核感染的能力受损，可表现为肺组织结核肉芽肿中Fox3+调节性T细胞特征性聚集明显减少及肺部炎性浸润增加，给予输注野生型巨噬细胞后调节性T细胞聚集增加且肺部炎性浸润减轻[23]。同时，TLR缺陷型小鼠肺组织中IL-23表达受抑制导致T(h)17细胞数量降低和趋化因子(CXCL9、CXCL10、CXCL11)合成减少[24]。而MyD88基因敲除小鼠更易受结核菌感染[25-26]。此外，TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR8和TLR9基因多态性的改变与结核病的患病风险相关[9,15,27-29]。

2.2 TLRs介导结核菌的获得性免疫过程 抗原呈递细胞主要包括巨噬细胞和树突状细胞，在联系天然免疫和获得性免疫间起着关键性作用，在天然免疫应答中，结核菌上的病原体相关分子模式(如相对分子质量为19 000的脂蛋白)被抗原呈递细胞膜上的TLRs(主要为TLR2或TLR4)识别并结合，促进树突状细胞的分化成熟，上调辅助刺激分子和主要组织相容性抗原分子Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ,MHCⅡ)的转录表达，继而激活T细胞，促使其进一步释放促炎性细胞因子，为适应性免疫T细胞应答做准备[4,14,30]。TLRs在机体获得性免疫反应的激活中是必不可少的，受结核菌感染的巨噬细胞上调多种抗菌免疫效应基因的表达，这些基因与巨噬细胞在能激动TLR2或TLR4的结核菌细胞组分刺激下所合成靶基因种类基本相同；而MyD88功能缺陷的小鼠无法发挥抗原特异性的Th1细胞反应[30]。可见，天然免疫和获得性免疫反应的协同作用才能有效地对抗结核菌的感染。此外，结核菌裂解物中的脂蛋白成分，如载脂蛋白G和相对分子质量为19 000的载脂蛋白，经与TLR2/TLR1异二聚体相互作用，能不依赖于抗原呈递细胞的介导而直接激活CD4+记忆T细胞，并诱导细胞因子释放和天然免疫细胞共刺激分子表达，从而发挥直接调节获得性免疫反应的作用[31]。

3 TLRs介导结核分枝杆菌的免疫逃避机制

TLRs除了具有调节天然免疫和获得性免疫应答以促进机体清除结核菌的作用外，还参与结核菌免疫逃逸机制的发生过程。通常，当结核菌入侵机体后即启动一系列免疫防御反应，包括释放细胞因子γ干扰素与巨噬细胞表面受体结合，激活Janus激酶/信号转导子和转录激活子信号通路，导致信号转导子和转录激活子α亚基发生磷酸化形成二聚体而转移入核，特异性地结合位于启动子区域的γ干扰素活化序列，诱导MHCⅡ反式激活子(MHCⅡtransactivator,CⅡTA)的活化，从而上调MHCⅡ表达。然而，结核菌细胞膜上的部分脂蛋白，如相对分子质量为19 000的脂蛋白、载脂蛋白G、载脂蛋白A、PhoS1和CFP-10等，可通过TLR2/MyD88介导的信号途径抑制巨噬细胞或树突状细胞表面MHCⅡ分子的表达水平，降低其抗原呈递作用，造成结核菌无法被CD4+T细胞或CD8+T细胞识别并削弱T细胞介导的抗结核菌炎症反应效能，同时巨噬细胞中由TLR2调控的氧化杀菌效应亦受抑制，不仅不利于获得性免疫反应产生，还导致结核菌在巨噬细胞中的长期存活[1,4,11,30,32-33]。结核杆菌诱导的MHCⅡ表达下调的可能机制如下。①MHCⅡ基因启动子受抑制：CⅡTA作为转录激活因子能特异性地结合于MHCⅡ编码基因的启动子区域，上调MHCⅡ表达。研究发现，结核菌能剂量依赖性地抑制由干扰素γ刺激后巨噬细胞内CⅡTA和MHCⅡ的表达水平，推测胞内CⅡTA表达量下降导致了MHCⅡ基因启动子受抑制[34]。②CIITA活性的降低：当TLRs受刺激后其下游信号分子MyD88/IRAK/TRAF6/NF-κB/MAPKs依次被激活，诱导CCAATT/增强子结合蛋白β和CCAATT/增强子结合蛋白δ结合到CⅡTA启动子区域，抑制CⅡTA活性而下调MHCⅡ的表达水平[35]。结核菌细胞壁上的丝氨酸水解酶1通过抑制TLR2-MyD88信号途径的转导阻碍巨噬细胞抗炎效应的发挥，当丝氨酸水解酶1发生突变后TLR2-MyD88的抑制解除，使细胞内抗炎细胞因子的合成与释放增加，故推测结核菌依靠其细胞壁上的某些组分(如丝氨酸水解酶1)阻碍巨噬细胞表面TLR2的活化，逃避宿主细胞的早期识别，延缓抗原呈递过程，影响获得性免疫的建立，限制机体抗炎症反应的强度，从而促进疾病的进展[26]。此外，部分研究发现TLRs信号途径的异常能干扰巨噬细胞内吞噬体的成熟过程和功能发挥，从而影响结核菌的杀伤效应[36]。但也有另外的研究不支持这一结论，认为吞噬体的成熟并不依赖于TLRs信号通路的调节[37]。尽管有争议的存在，但普遍观点还是认为TLRs信号通路是决定吞噬作用后吞噬体去向的关键因素[3]。因此，通过调节TLRs介导的免疫杀菌反应和免疫逃避之间的平衡有助于机体结核菌的清除以控制感染发展。

4 结 语

TLRs在调控结核菌感染免疫反应中的机制作用十分复杂，虽然诸多问题仍有待解答，如各TLRs成员间如何协作参与结核菌感染免疫应答的发生、发展，影响TLRs在介导活化或削弱宿主免疫反应中的关键因素是什么，改变相应因素能否彻底清除潜伏的结核菌等，但研究表明利用结核菌相关组分所制备的免疫佐剂或纯化的TLRs激动剂可直接刺激免疫细胞以激活天然免疫和获得性免疫系统，有望逆转结核菌对免疫系统的抑制作用，增强机体抗菌免疫能力。同时，随着更全面深入的研究对TLRs在介导宿主对结核杆菌感染免疫应答过程中的调控机制的阐明，将为新的结核菌疫苗和抗结核免疫调节剂的研制及开展行之有效的结核病免疫治疗提供参考[2,4,14,26,38]。

[1] Harding CV,Boom WH.Regulation of antigen presentation by Mycobacterium tuberculosis:a role for Toll-like receptors[J].Nat Rev Microbiol,2010, 8(4):296-307.

[2] Kleinnijenhuis J,Oosting M,Joosten LA,etal.Innate immune recognition of Mycobacterium tuberculosis[J].Clin Dev Immunol,2011,2011:405310.

[3] Yoshida A,Inagawa H,Kohchi C,etal.The role of toll-like receptor 2 in survival strategies of Mycobacterium tuberculosis in macrophage phagosomes[J].Anticancer Res,2009,29(3):907-910.

[4] Quesniaux V,Fremond C,Jacobs M,etal.Toll-like receptor pathways in the immune responses to mycobacteria[J].Microbes Infect,2004,6(10):946-959.

[5] Medzhitov R,Preston-Hurlburt P,Janeway CA Jr.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J].Nature,1997,388(6640):394-397.

[6] Kumar H,Kawai T,Akira S.Toll-like receptors and innate immu-nity[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,388(4):621-625.

[7] Kawai T,Akira S.Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity[J].Immunity,2011,34(5):637-650.

[8] Hossain MM,Norazmi MN.Pattern recognition receptors and cytokines in mycobacterium tuberculosis infection-the double-edged sword?[J].Biomed Res Int,2013,2013:179174.

[9] Dalgic N,Tekin D,Kayaalti Z,etal.Relationship between toll-like receptor 8 gene polymorphisms and pediatric pulmonary tuberculosis[J].Dis Markers,2011,31(1):33-38.

[10] O′Neill LA.How Toll-like receptors signal:what we know and what we don′t know[J].Curr Opin Immunol,2006,18(1):3-9.

[11] Sanchez A,Espinosa P,Garcia T,etal.The 19 kDa Mycobacterium tuberculosis lipoprotein(LpqH) induces macrophage apoptosis through extrinsic and intrinsic pathways:a role for the mitochondrial apoptosis-inducing factor[J].Clin Dev Immunol,2012,2012:

950503.

[12] Bulut Y,Michelsen KS,Hayrapetian L,etal.Mycobacterium tuberculosis heat shock proteins use diverse Toll-like receptor pathways to activate pro-inflammatory signals[J].J Biol Chem,2005,280(22):20961-20967.

[13] Jung SB,Yang CS,Lee JS,etal.The mycobacterial 38-kilodalton glycolipoprotein antigen activates the mitogen-activated protein kinase pathway and release of proinflammatory cytokines through Toll-like receptors 2 and 4 in human monocytes[J].Infect Immun,2006,74(5):2686-2696.

[14] Kim K,Sohn H,Kim JS,etal.Mycobacterium tuberculosis Rv0652 stimulates production of tumour necrosis factor and monocytes chemoattractant protein-1 in macrophages through the Toll-like receptor 4 pathway[J].Immunology,2012,136(2):231-240.

[15] Thada S,Valluri VL,Gaddam SL.Influence of Toll-like receptor gene polymorphisms to tuberculosis susceptibility in humans[J].Scand J Immunol,2013,78(3):221-229.

[16] Schnappinger D,Schoolnik GK,Ehrt S.Expression profiling of host pathogen interactions:how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another[J].Microbes Infect,2006,8(4):1132-1140.

[17] Sasindran SJ,Torrelles JB.Mycobacterium Tuberculosis Infection and Inflammation:what is Beneficial for the Host and for the Bacterium?[J].Front Microbiol,2011,2:2.

[18] Aderem A,Ulevitch RJ.Toll-like receptors in the induction of the innate immune response[J].Nature,2000,406(6797):782-787.

[19] Xu Y,Jagannath C,Liu XD,etal.Toll-like receptor 4 is a sensor for autophagy associated with innate immunity[J].Immunity,2007,27(1):135-144.

[20] Yu X,Li C,Hong W,etal.Autophagy during Mycobacterium tuberculosis infection and implications for future tuberculosis medications[J].Cell Signal,2013,25(5):1272-1278.

[21] Lopez M,Sly LM,Luu Y,etal.The 19-kDa Mycobacterium tuberculosis protein induces macrophage apoptosis through Toll-like receptor-2[J].J Immunol,2003,170(5):2409-2416.

[22] Korbel DS,Schneider BE,Schaible UE.Innate immunity in tuberculosis:myths and truth[J].Microbes Infect,2008,10(9):995-1004.

[23] McBride A,Konowich J,Salgame P.Host defense and recruitment of Foxp3(+) T regulatory cells to the lungs in chronic Mycobacterium tuberculosis infection requires toll-like receptor 2[J].PLoS Pathog,2013,9(6):e1003397.

[24] Teixeira-Coelho M,Cruz A, Carmona J,etal.TLR2 deficiency by compromising p19(IL-23) expression limits Th 17 cell responses to Mycobacterium tuberculosis[J].Int Immunol,2011,23(2):89-96.

[25] Fremond CM,Togbe D,Doz E,etal.IL-1 receptor-mediated signal is an essential component of MyD88-dependent innate response to Mycobacterium tuberculosis infection[J].J Immunol,2007,179(2):1178-1189.

[26] Madan-Lala R,Peixoto KV,Re F,etal.Mycobacterium tuberculosis Hip1 dampens macrophage proinflammatory responses by limiting toll-like receptor 2 activation[J].Infect Immun,2011,79(12):4828-4838.

[27] Zhang Y,Jiang T,Yang X,etal.Toll-like receptor -1, -2,and -6 polymorphisms and pulmonary tuberculosis susceptibility:a systematic review and meta-analysis[J].PLoS One,2013,8(5):e63357.

[28] Azad AK,Sadee W,Schlesinger LS.Innate immune gene polymorphisms in tuberculosis[J].Infect Immun,2012,80(10):3343-3359.

[29] Najmi N,Kaur G,Sharma SK,etal.Human Toll-like receptor 4 polymorphisms TLR4 Asp299Gly and Thr399Ile influence susceptibility and severity of pulmonary tuberculosis in the Asian Indian population[J].Tissue Antigens,2010,76(2):102-109.

[30] Schnare M,Barton GM,Holt AC,etal.Toll-like receptors control activation of adaptive immune responses[J].Nat Immunol 2001,2(10):947-950.

[31] Lancioni CL,Li Q,Thomas JJ,etal.Mycobacterium tuberculosis lipoproteins directly regulate human memory CD4(+) T cell activation via Toll-like receptors 1 and 2[J].Infect Immun,2011,79(2):663-673.

[32] Gupta D,Sharma S,Singhal J,etal.Suppression of TLR2-induced IL-12,reactive oxygen species,and inducible nitric oxide synthase expression by Mycobacterium tuberculosis antigens expressed inside macrophages during the course of infection[J].J Immunol,2010,184(10):5444-5455.

[33] Saraav I,Singh S,Sharma S.Outcome of Mycobacterium tuberculosis and Toll-like receptor interaction:immune response or immune evasion?[J].Immunol Cell Biol,2014,92(9):741-746.

[34] Wang Y,Curry HM,Zwilling BS,etal.Mycobacteria inhibition of IFN-gamma induced HLA-DR gene expression by up-regulating histone deacetylation at the promoter region in human THP-1 monocytic cells[J].J Immunol,2005,174(9):5687-5694.

[35] Pennini ME,Liu Y,Yang J,etal.CCAAT/enhancer-binding protein beta and delta binding to CIITA promoters is associated with the inhibition of CIITA expression in response to Mycobacterium tuberculosis 19-kDa lipoprotein[J].J Immunol,2007,179(10):6910-6918.

[36] Podinovskaia M,Lee W,Caldwell S,etal.Infection of macrophages with Mycobacterium tuberculosis induces global modifications to phagosomal function[J].Cell Microbiol,2013,15(6):843-859.

[37] Yates RM,Russell DG.Phagosome maturation proceeds independently of stimulation of toll-like receptors 2 and 4[J].Immunity,2005,23(4):409-417.

[38] Bakhru P,Sirisaengtaksin N,Soudani E,etal.BCG vaccine mediated reduction in the MHC-Ⅱ expression of macrophages and dendritic cells is reversed by activation of Toll-like receptors 7 and 9[J].Cell Immunol,2014,287(1):53-61.

Study on the Effect of Toll-like Receptors in Mediation of Immune Responses in Mycobacterium Tuberculosis Infection

GUOXue-ling,LIUHui-guo.

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Mycobacterium tuberculosis is the pathogenic agent of tuberculosis.The host immune responses have critical regulation effect on the defense and pathogenesis of tuberculosis.Toll-like receptors(TLRs),belonging to pattern recognition receptors family,act as key sensors of mycobacterial infections and can regulate innate immunity and adaptive immunity.Besides,TLRs participate in the immune evasion process of mycobacterium tuberculosis，so as to facilitate the incidence and development of chronic infection.The immune-adjuvant may help to regulate function of TLRs to enhance the host immune response and would become new direction for the prevention and treatment of tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis; Toll-like receptors; Innate immunity; Adaptive immunity； Immune evasion

R392.32； R378.911

A

1006-2084(2015)12-2142-04

10.3969/j.issn.1006-2084.2015.12.011

2014-09-29

2014-12-03 编辑：伊姗