桂茜雯，柳 菡，许 蔚，龚玉霞，徐牛生，丁 涛，费晓庆，林 宏，赵增运，沈崇钰，吴 斌，张 睿

（1．江苏出入境检验检疫局，江苏南京 210001；2．赛默飞世尔科技（中国）有限公司，上海 201210）

葡萄酒中26种添加剂的高效液相色谱－高分辨质谱筛查法

桂茜雯1，柳 菡1，许 蔚1，龚玉霞1，徐牛生2，丁 涛1，费晓庆1，林 宏1，赵增运1，沈崇钰1，吴 斌1，张 睿1

（1．江苏出入境检验检疫局，江苏南京 210001；2．赛默飞世尔科技（中国）有限公司，上海 201210）

建立了一种高效液相色谱－四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱同时筛查葡萄酒中26种添加剂（包括防腐剂、抗氧化剂、甜味剂和合成着色剂）的方法。葡萄酒经甲醇－水溶液（1∶9，V／V）稀释后，采用超高效C18柱分离，高分辨质谱全扫描模式提取目标化合物的精确质量数，外标法定量。在0．1～5mg／L范围内，26种添加剂的线性关系良好，线性相关系数均大于0．99。干红葡萄酒和干白葡萄酒基质中，2、4、20mg／kg 3个添加水平的回收率均在78．5％～118．8％之间，相对标准偏差小于12．7％，定量限为2mg／kg。该方法的前处理快速、简单，高分辨质谱定量结果的准确度和精密度高，可用于葡萄酒中添加剂的筛查。

四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱；高效液相色谱；葡萄酒；添加剂

国家食品添加剂使用标准GB 2760—2011和葡萄酒国家标准GB 15037—2006，都对葡萄酒中添加剂的使用做出了明确的规定，即葡萄酒中不得添加合成着色剂、甜味剂、香精和增稠剂，并规定苯甲酸的限量为50mg／kg，山梨酸的限量为200mg／kg。美国FDA和欧盟食品添加剂标准中也对山梨酸有相同的限量要求。但葡萄酒市场依然有不少违规使用添加剂或者添加剂超标的现象，例如防腐剂、甜味剂和着色剂等添加剂超标，甚至有不法商贩利用酒精、水和着色剂、甜味剂、香精等添加剂进行勾兑，假冒名牌葡萄酒或者冒充自制葡萄酒出售，扰乱了葡萄酒市场，危害消费者健康。

目前，针对葡萄酒中添加剂的检测方法有高效液相色谱法［1－2］、气相色谱法［3］、气相色谱－质谱联用法［4－5］、高效液相色谱－质谱联用法［68］、毛细管电泳法［9］和离子色谱法［10］等。针对不同种类的添加剂，以上文献报道了不同的前处理和仪器检测方法，但均存在有机溶剂用量大、耗时长和耗材较多等问题。陈晓红等［7］对葡萄酒中9种防腐剂和甜味剂进行LCMS／MS检测方法研究，并阐述了质谱裂解途径；冯峰等［6］介绍了检测葡萄酒中14种添加剂的LC－MS／MS方法，并探讨了色谱分离中缓冲液的浓度对质谱检测灵敏度的影响。这2篇文献均采用低分辨质谱检测添加剂，无法对其他添加剂进行筛查分析，有一定的局限性。黎永乐等［8］采用液相色谱－线性离子阱／静电场轨道阱高分辨质谱检测葡萄酒中15种合成色素，用二级质谱比对定性，同时进行未知物的筛查，但由于采用WAX小柱前处理富集净化，并用苯基柱分离，无法检出葡萄酒中其他类型的添加剂。而高效液相色谱－四极杆／静电场轨道阱质谱可以检测目前常见的多种防腐剂、甜味剂和着色剂等添加剂，并且可以同时完成已知添加剂的测定和未知添加剂的筛查。

本研究选用甲醇－水溶液稀释葡萄酒，高效液相色谱－四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱法快速筛查葡萄酒中26种添加剂，采用全扫描模式测定，通过提取一级质谱精确质量数进行定性定量分析，以期建立检测葡萄酒中添加剂的快速筛查方法。

1 实验部分

1．1 仪器、试剂和材料

四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱仪QExactive：美国Thermo－Fisher公司产品，配有H－ESIⅡ源；液相色谱系统：Dionex 3000高压液相色谱，带自动进样器；KH－500B超声仪：昆山禾创超声仪器有限公司产品；ELGA－Q15高纯水发生器：英国Elga公司产品。

苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、丁基羟基茴香醚、2，6－二叔丁基对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、纽甜、柠檬黄、日落黄、诱惑红、苋菜红、丽春红4R、赤藓红、偶氮玉红、荧光桃红、亮蓝和新红等添加剂标准品（纯度均不小于90％）：美国Sigma和Dr．Ehrenstorfer公司产品；甲醇、醋酸铵和甲酸（色谱纯）：德国Merck公司产品；实验用水为去离子水。

1．2 溶液的配制

标准储备液的配制：分别准确称取100mg标准品于10mL容量瓶中，用甲醇－水溶液（3∶7，V／V）溶解，定容，配制成10g／L标准储备液，于4℃冷藏。

混合标准工作溶液的配制：准确量取适量的标准储备液，用甲醇－水溶液（3∶7，V／V）逐级稀释，得到10mg／L混合标准工作溶液，于4℃冷藏。

1．3 样品前处理

准确称取（1±0．01）g葡萄酒样品于10mL

容量瓶中，加入5mL甲醇－水溶液（1∶9，V／V），涡旋后超声5min，冷却至室温，定容，加盖混匀。吸取部分溶液转移至进样瓶中，供仪器测定。

1．4 仪器条件

1．4．1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Kinetex C18柱（100mm×4．6mm×2．6μm）；流动相：甲醇（A），5mmol／L醋酸铵水溶液（B）；流速0．40mL／min；柱温：室温；进样体积10μL；分析时间13min；梯度洗脱程序列于表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution program

1．4．2 质谱条件 加热源温度300℃，毛细管温度350℃，喷雾电压3 000V（负离子模式），质量扫描范围m／z 100～1 000，一级质谱全扫描分辨率35 000，C－trap最大容量（AGC）3× 106，C－trap最长等待时间200ms。

2 结果和讨论

2．1 前处理方法的优化

为减少提取和净化过程中添加剂的损失，拟将葡萄酒样品用甲醇－水溶液（1∶9，V／V）稀释，过针式滤膜，直接进样分析。实验发现，添加回收样品过尼龙滤膜后，滤膜上留有颜色，且部分着色剂的回收率显著降低，推测该滤膜对着色剂有吸附和阻挡作用。因此，本研究考察了混合纤维素（MCM）、尼龙（Nylon）、亲水型聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏氟乙烯（PVDF）和聚醚砜（PES）等5种材质的滤膜对着色剂回收率的影响。通过加标回收实验发现：MCM和Nylon滤膜对着色剂基本完全吸附，几乎无回收；PTFE和PES的吸附作用最小，但对赤藓红和荧光桃红B这两种分子质量较大的物质仍损失50％以上。而不过滤膜直接进样时，各添加剂的回收率均在80％～120％之间，无明显的基质效应。因此，确定前处理方法为样品在稀释后不过滤膜，直接进样分析。

2．2 色谱条件的优化

冯峰等［6］同时检测多种甜味剂和着色剂，陈晓红等［7］同时检测多种防腐剂和添加剂，两篇文献均采用C18色谱柱分离；而黎永乐［8］等则选用了苯基色谱柱检测性质相似的着色剂。本研究需同时检测多种性质不同的添加剂，因此采用高效C18色谱柱进行方法开发。

实验比较了几种有机相和水相的组成，有机相主要考察了乙腈和甲醇，水相主要考察了纯水和5mmol／L醋酸铵水溶液。由于采用负离子模式检测，流动相中加入酸会抑制负离子的形成，所以不对添加酸的流动相进行考察。

实验发现，使用乙腈作为流动相时，苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸等酸性化合物的峰形较差，拖尾严重，且脱氢乙酸由于峰形宽，造成信噪比低，在浓度为100μg／L时已无法检出，无法满足检测灵敏度的要求。改用甲醇作流动相后，各类酸性化合物的峰形明显改善，信噪比提高，其他化合物则无明显影响。

使用纯水作为流动相时，较高浓度标准溶液的峰形不佳，在水中加入5mmol／L醋酸铵后，高浓度标准溶液的峰形明显改善，且分离效果更好。苋菜红和丽春红4R是同分异构体，在该色谱条件下，能有效的基线分离，苋菜红在4．77min出峰，丽春红4R在5．10min出峰，其离子流图示于图1。因此，本实验最终采用甲醇－5mmol／L醋酸铵水溶液作为流动相。

2．3 质谱条件的优化

本研究分析的添加剂或含有羟基（—OH），或以K＋、Na＋盐形式存在，在极性溶剂中，易失去H＋、K＋、Na＋等离子，形成带负电荷的基团，适合在负离子模式下检测。

含—OH的苯甲酸、山梨酸、丁基羟基茴香醚、2，6－二叔丁基对甲酚、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、纽甜和对羟基苯甲酸酯类等添加剂失去H＋，形成［M－H］－离子。含Na＋或K＋的甜蜜素、糖精钠和安赛蜜，在失去所有Na＋或K＋后，无位点或部分位点与H＋结合，最终形成［M－mNa（K）＋nH］（m－n）－离子。其中，m

指化合物含有的所有Na＋或K＋的个数，n指该化合物电离后，H＋与失去Na＋或K＋的位点结合的个数；m－n为该离子携带的电荷数；质荷比（m／z）为化合物电离后形成的离子质量与所带电荷的比值。

图1 标准溶液中苋菜红和丽春红4R的选择离子流图Fig．1 Extract ion chromatogram of Amaranth and Ponceau 4R in standard solution

以全扫描模式进样分析，对得到的总离子流图提取所有可能产生的离子质荷比，发现大部分含多个Na＋或K＋的化合物都会同时产生多个离子。本研究主要选取m／z响应最高的作为定量离子。

苋菜红和丽春红4R是同分异构体，进单标分析时发现，二者的保留时间略有不同，但都会形成［M－3Na＋H］2－离子m／z267．982 70。另外，苋菜红还单独形成［M－3Na］3－离子m／z 178．318 71，其响应值比m／z 267．983 52略低。考虑到定性的特异性，以m／z 178．318 71作为苋菜红的定量离子，m／z 267．983 52作为丽春红4R的定量离子。

由于本方法利用一级质谱进行筛查，依靠提取精确质量数进行定性，因此理论质量数与实际测得的质量数相对偏差越小，筛查结果的可信程度越高。由于高分辨质谱为新开发仪器，目前暂无准确的定性偏差指标，所以，本实验规定，化合物实测质荷比与理论质荷比相差不超过±1×10－5，即可认定为相同物质，阳性样品可与标准物质比对保留时间和精确质量数来进行进一步的定性定量分析。葡萄酒中26种添加剂的理论质荷比和实测质荷比列于表2。由表2中数据可以看出，二者的相对偏差均小于5×10－6，说明该结果有效可靠。同时，表2中也列出了分子式、分子离子峰质荷比和理论精确质量数等信息。

结合全扫描模式检测实际样品所获得的谱图，对新发现的非法添加物可以通过提取其精确质量数进行筛查，有利于追溯工作的展开和数据收集。

表2 26种添加剂信息表Table 2 Information table of 26 kinds of additives

续表2

2．4 线性范围、定量限、回收率和精密度

以标准品峰面积为纵坐标，工作溶液浓度（μg／L）为横坐标，绘制标准工作曲线（0．1～5mg／L，标准曲线权重为1／x），26种添加剂的线性相关系数r均大于0．99。以26种添加剂谱峰的信噪比S／N＝3时的进样浓度为检出限，检出限范围在0．05～50μg／L，结果列于表3。根据其中灵敏度最低物质的信噪比进行添加回收，确定方法的定量下限（S／N＝10）为2mg／kg。在阴性干白葡萄酒和干红葡萄酒样品中添加26种添加剂的标准溶液，添加水平为2、4和20mg／kg，每个添加水平平行测定6个样品，平均回收率在78．5％～118．8％之间，精密度为1．5％～12．7％，结果列于表3。其中，阴性干红葡萄酒样品中添加2mg／kg的26种添加剂的选择离子流图示于图2。

2．5 实际样品检测

对来自法国、意大利、澳大利亚、西班牙和中国等国家不同产地的50余份葡萄酒样品进行分析，共检出山梨酸阳性样品2个，检出值分别为130．4mg／kg和100．9mg／kg；安赛蜜阳性样品1个，检出值为3．2mg／kg；诱惑红阳性样品1个，检出值为16．1mg／kg；丽春红4R阳性样品1个，检出值为17．3mg／kg；亮蓝阳性样品1个，检出值为5．2mg／kg；其余样品均没有检出。

图2 阴性干红葡萄酒中添加2 mg／kg的26种添加剂的选择离子流图Fig．2 Extract ion chromatogram of a blank dry red wine spiked 26 kinds of additives（2 mg／kg）

表3 干红葡萄酒中26种添加剂的加标回收率和精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precisions of 26 kinds of additives spiked in blank dry red wine（n＝6）

3 结论

本研究利用高效液相色谱－四极杆／静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查葡萄酒中26种添加剂。该方法快速、准确，高分辨质谱在样品分析中消除了基质干扰，提高了分析定性的准确性，方法的定量限可满足国内外对添加剂限量的要求，且能够应用于未知物筛查，有利于追溯工作的展开。

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Screening of 26 Kinds of Additives in Wines by High Performance Liquid Chromatography－High Resolution Mass Spectrometry

GUI Qian－wen1，LIU Han1，XU Wei1，GONG Yu－xia1，XU Niu－sheng2，DING Tao1，FEI Xiao－qing1，LIN Hong1，ZHAO Zeng－yun1，SHEN Chong－yu1，WU Bin1，ZHANG Rui1
（1．Jiangsu Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing210001，China；2．Thermo Fisher Scientific，Shanghai 201210，China）

The method for screening of 26kinds of additives in wine was developed by liquid chromatography－quadrupole／orbitrap high resolution mass spectrometry．The additives were separated by C18high performance column after the wines were diluted by methanol－water mixtures（1∶9，V／V）．This method was quantitatived by external standard method using full scan mode of high resolution mass spectrometer extracting accurate mass extraction of the target compound．Good linearity is obtained in the range of 0．1－5mg／L for 26kinds of additives with the linear correlation coefficients greater than 0．99．Satisfactory recoveries range from 78．5％to 118．8％at three levels of 2，4

quadrupole／orbitrap high resolution mass spectrometry；high performance liquid chromatography；wines；additives

O657．63

A

1004－2997（2015）02－0148－08

10．7538／zpxb．2015．36．02．0148

2014－03－17；

2014－09－01

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2013KJ41，2012KJ31，2012BAK08B01）资助

桂茜雯（1985—），女（汉族），江苏南京人，工程师，食品科学与工程专业。E－mail：wendy＿gqw＠aliyun．com

and 20mg／kg are gained in dry red and white wines with the relative standard deviation less than 12．7％．The limit of quantitation（LOQ）is 2mg／kg．This method is suitable for screening of 26kinds of additives in wines by its fast and simple preprocessing with high accuracy and precision of high resolution mass spectrometry．