尹文龙　郝英魁　全红娜　潘雁涛　蒋庆峰

[摘 要] 目的：建立YNC 3个异构体的HPLC拆分法。方法：采用CHIRALPAK AD-H柱（4.6×250 mm，5 μm），以正己烷-异丙醇（82：18）为流动相，检测波长232 nm。结果与结论：在选定色谱条件下YNC与其3个异构体完全分离，可用于本品的质量控制。

[关键词] YNC；异构体；高效液相色谱；手性固定相

中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2015）02-061-03

YNC是一种新型选择性胆固醇吸收抑制剂，有调节血脂功效，目前国内尚无厂家生产。YNC结构中有3个手性中心，理论存在多个光学异构体，然而临床以单一构型给药。为了确保用药安全，控制YNC异构体杂质限度具有重要意义。

本文建立了对YNC其中3个异构体HPLC拆分法，此方法灵敏度高，重复性好，为YNC进一步质量研究提供可靠分析方法及理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters E2695高效液相色谱仪（2489型检测器，美国Waters公司）；Empower3色谱软件（美国Waters公司）。

1.2 试剂

正己烷、异丙醇、乙醇（色谱级，Fisher Scientific）；Milli-Q超纯水；YNC供试品（天津药物研究院，批号：1401，1402，1403）；YNC1、YNC2、YNC3异构体对照品（天津药物研究院）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：CHIRALPAK AD-H （4.6×250 mm，

5 μm）；流动相：正己烷-异丙醇（80：20）；检测波长232 nm；流速：1 mL/min；柱温30 ℃；进样量

20 μL。

2.2 溶液配制

精密称取YNC 20 mg于10 mL容量瓶中，加2 mL异丙醇溶解，用正己烷-异丙醇（80：20）定容，各取1 mL至100 mL容量瓶中，用正己烷-异丙醇（80：20）稀释至刻度，浓度为 20.00μg/mL，作为YNC储备液，同法分别配置YNC1、YNC2、YNC3异构体储备液，各异构体储备液最终浓度依次为YNC1 20.3 μg/mL、YNC2为21.0 μg/mL、YNC3为 22.0 μg/mL。

2.3 专属性

2.3.1 精密称YNC供试品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL异丙醇溶解，用正己烷-异丙醇（80：20）定容。按“2.1”项下色谱条件，进样分析，记录色谱图。同法进样YNC1、YNC2、YNC3异构体储备液，各样品保留时间为YNC：20.001min；YNC1：14.332min；YNC2：21.830min；YNC3：25.695min。

2.3.2 加热破坏 精密称取YNC供试品100 mg至50 mL烧瓶中，加10 mL异丙醇溶解，正己烷-异丙醇（80：20）定容至刻度，于80 ℃水浴回流加热0.5 h，放至室温。按“2.1”项下色谱条件，分别进样分析，记录色谱图，同法以异丙醇作为加热试验空白对照。

2.3.3 光照破坏 精密称取YNC供试品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL异丙醇溶解，用正己烷-异丙醇（80：20）定容，于光照室（光照强度4500xl）放置一天，按“2.1”项下色谱条件，分别进样分析，记录色谱图，同法以正己烷-异丙醇（80：20）作为光照试验空白对照。

结果表明，在上述条件下均有不同程度降解，并且各破坏条件下降解产物均与主峰达到良好分离，说明本法专属性较强。

2.4 系统适应性实验

分别称取YNC、YNC1、YNC2、YNC3适量，用正己烷-异丙醇（80：20）溶解并稀释制成每mL约含YNC为2μg，YNC1、YNC2、YNC3约为0.5μg溶液，即为系统适应性溶液。按“2.1”项下色谱条件，连续进样5针系统适应性溶液，记录色谱图，见图1。

1.YNC1；2.YNC；3.YNC2；4.YNC3

上述色谱条件下分析，理论板数以YNC和其异构体计均大于3000，YNC峰及其异构体与相邻色谱峰间分离度大于1.5，拖尾因子符合要求，如表1所示。

2.5 检测限与定量限

按“2.1”项下色谱条件，分别将YNC、YNC1、YNC2、YNC3储备液适当稀释至信噪比（S/N）10倍作为定量限，测得YNC定量限浓度为0.320 μg/mL、YNC1为0.324 μg/mL、YNC2为0.210 μg/mL、YNC3为0.308 μg/mL；稀释至信噪比（S/N）3倍作为检测限，测得YNC为0.0960μg/mL检测限浓度为YNC1为 0.0972μg/mL、YNC2为0.0630 μg/mL、YNC3为0.0924 μg/mL。

2.6 线性

精密量取YNC储备液各0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、2.0 mL至10 mL容量瓶中，用正己烷-异丙醇（80：20）定容，并取其定量限溶液，即为各浓度线性溶液。同法配置YNC1、YNC2、YNC3各线性溶液。按“2.1”项下色谱条件，每浓度进样3针，记录色谱图。

以浓度（μg/mL）为横坐标，以3针峰面积平均值为纵坐标，进行线性回归，结果见表2。

结果表明YNC1、YNC2、YNC3对照品在各自测定浓度范围内线性关系良好。

2.7 重复性

精密称6份YNC供试品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL异丙醇溶解，用正己烷-异丙醇（80：20）定容。按“2.1”项下色谱条件，分别进样分析，记录色谱图。按“2.1.”项下：总杂质峰面积和YNC主峰面积计算得主峰峰面积RSD为1.49% 总杂质RSD为1.44%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性

精密称取YNC供试品20 mg至10 mL容量瓶中，加2 mL异丙醇溶解，用正己烷-异丙醇（80：20）定容，室温放置，在1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按“2. 1”项下色谱条件，分别进样分析，记录色谱图。按总杂质峰面积和YNC主峰面积计算得主峰峰面积RSD为1.20% 总杂质RSD为3.25%，表明本品在24h内基本稳定。

2.9 回收率

精密称9份批YNC 20 mg至10 mL容量瓶中，每份加2 mL异丙醇溶解，然后每3份为1组，依次加入YNC1、YNC2、YNC3储备液各0.8 mL、1.0 mL、1. 2 mL至3组容量瓶中，用正己烷-异丙醇（80：20）定容，即得9份回收液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样分析，记录色谱图。

上述色谱条件下分析，计算回收率，结果见表3。

结果显示YNC1、YNC2、YNC3回收率均在90%～110%之间，符合要求。

2.10 耐用性实验

分别考察了流速变化±0.1 mL/min、柱温变化±3 ℃、检测波长变化±3 nm、流动相比例变化±3%条件下系统适用性和有关物质含量变化，表明系统适用性均符合要求，异构体含量无明显变化，表明方法耐用性良好。

2.11 校正因子测定

按线性测定方法计算得YNC对照品线性方程为Y=53515X-4851.9 R=0.9994。则YNC1、YNC2、YNC3校正因子分别为0.93、0.97、1.07。各异构体校正因子均在0.9～1.1之间，可按不加校正因子主成分自身对照法测定各异构体含量。

2.12 样品异构体检查

精密称取YNC原料药20 mg于10 mL容量瓶中，加2 mL异丙醇溶解，用正己烷-异丙醇（80：20）定容，配置成2 mg/mL YNC供试品溶液。精密量取供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用正己烷-异丙醇（80：20）定容，作为对照溶液。取对照溶液按“2.1”项下色谱条件，分别进样分析，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰峰高为满量程10%～20%。再按“2.1”项下色谱条件，取供试品溶液进样分析，结果只检出YNC2异构体，按不加校正因子主成分自身对照法计算，YNC1401、1402、1403批原料药中异构体YNC2含量分别为0.07%、0.06%、0.07%；各批结果均小于0.1%，即小于对照溶液峰面积1/10，结果见表4。

3 讨论

3.1 色谱柱选择

我们初步尝试CHIRALPAK IA、AS-3、AD-H柱（规格均为4.6×250 mm，5 μm）对样品进行分离考察，结果显示，各异构体在IA柱下保留时间接近，分离度差；在AS-3柱中各异构体峰理论塔板数较低；AD-H柱能对其3个异构体实现分离，且分离效果良好，因此选择AD-H。

3.2 流动相优化

考察了正己烷-乙醇、正己烷-异丙醇2个流动相体系，异构体定位试验显示，2个体系中各异构体出峰时间和出峰次序区别很大，由于正己烷-异丙醇体系中各峰理论塔板数明显高于正己烷-乙醇体系，见表5。因此选用正己烷-异丙醇作为本试验流动相体系。

4 结论

用HPLC法对手性药物拆分主要有手性衍生化法，手性流动相添加剂法，手性固定相法，其中手性固定相法应用最为普遍。CHIRALPAK AD-H柱固定相为表面涂敷了手性多聚物[直链淀粉-三（3，5-二甲基苯氨基甲酸酯）]球形硅胶，对大多数异构体有极高手性能力。

本文采用CHIRALPAK AD-H柱成功拆分了YNC3个光学异构体，分离度良好。所建立灵敏度高，分析方法快速，适用于YNC原料药中异构体杂质检查。

参 考 文 献

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