鲍方印，肖明松，王松华，何庆元

(安徽科技学院 生命科学学院，安徽 凤阳 233100）

赤链蛇(Dinodon rufozonatum)属爬行纲、蛇目、游蛇科，是一种国内分布广泛的后沟牙类毒蛇[1]。该物种已被列入中国国家林业局2000年8月1日发布的《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》[2]。赤链蛇在临床应用上有治疗慢性结核性瘘管的作用，药理上有抗炎、镇痛、催眠、镇静和抗惊厥作用，有一定的医学研究价值[3]。关于赤链蛇的研究，早期主要集中在地理分布、生态习性、药用价值等方面，近期深入到生理生化和分子水平，如陈壁辉报道了赤链蛇的栖息环境、活动和捕食习性，蔡亚非等[4]发现赤链蛇达氏腺内与特有取食习惯的关系，张蕾等[5]研究了赤链蛇的消化道中嗜银细胞分布、细胞形态和功能，杨超等采用RT－PCR技术研究了赤链蛇不同组织Sox基因的表达[6]，但关于赤链蛇目前的资源现状和遗传多样性的研究却很少见报道。线粒体DNA(mtDNA)具有分子小、结构简单、母系遗传、进化速度快、几乎不发生重组、不同区域进化速度存在差异等特点，是一个相对独立的复制单位，已被广泛地应用于类群识别、地理隔离、起源、分化和扩散、遗传多样性等领域[7－8]。本文利用mtDNA控制区序列对安徽省赤链蛇野生群体进行遗传分析，研究赤链蛇的系统发育和地理分布规律，为赤链蛇野生种群的保护和开发利用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

赤链蛇样本14个，分别来自淮北、江淮、皖西、皖南和沿江等5个地区的6个种群，具体见表1。标本采用95%乙醇固定，－20℃保存。

表1 赤链蛇样本编号及采集地Table 1 Names and resources of tested samples

1.2 DNA提取、PCR扩增和序列测定

改良苯酚氯仿抽提法，从每个样本的肌肉组织中经匀浆、裂解、消化提取、纯化，得到基因组DNA，置于－20℃冰箱保存备用。PCR反应总体积为30μL，其中含10×buffer反应缓冲液3.0 μL，3μL dNTP(2.5mmol/L)，0.4μmol/L 引物，0.25 μL Taq酶，25ng DNA，用灭菌双蒸馏水补足体积。94 ℃下预变性 5 min，94 ℃下变性30s，58℃下退火1min，72℃下延伸1 min，72℃下延伸10min，4℃保存。扩增产物在 1.2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果在凝胶图像分析系统中拍照、保存。产物送往上海生工生物工程技术有限公司进行序列测定，测得的序列用Clustal X 1.81程序[9]进行比对，并辅以人工校对，进行同源性比较。

1.3 统计分析

采用CLUSTALw软件将测序结果进行对位排序，用分子进化遗传分析软件MEGA4.0软件计算不同序列间的碱基替代数、变异位点、简约信息位点数、颠换百分比、转换/颠换比率和Kimura两参数(2 parameter)距离[13];用DNASTAR4.0软件计算两两序列的遗传相似度和序列差异百分比。通过MEGA4.0软件构建NJ树，在重建系统发生树时，去除两两对位序列中的缺失，应用自举法(Bootstrap)评估系统树[11]。

2 结果

2.1 mtDNA D－Loop序列及其变异

测定了来自6个种群的14个赤练蛇样本，结果D－Loop序列的长为690bp，经序列核对及氨基酸转换，没有缺失或插入。同时，在所有序列中共发现6个不同的单倍型(表2)。在这6个序列中，共有24个位点呈现变异，其中13个简约信息位点。在所有的序列中，碱基组成的百分比中显示了G的相对缺乏，A+T的平均含量为60.2%，而C+G的平均含量为39.8%。核苷酸碱基的变异也存在很大差异，其中T－C的转换比A－G转换发生的多，颠换中只有A与T之间的颠换发生，没有A与C、C与G和G与T之间的颠换。

表2 赤链蛇D－Loop序列碱基组成频率(%)Table 2 Frequencies of base composition in the D－Loop gene fragments of Dinodon rufozonatum(%)

2.2 分子系统树的构建

在Kimura双参数距离中，所有6个单倍型间的数值在0.0016－0.1024，平均距离是0.0276。在序列差异百分比表中，所有单倍型间的数值在0.5% －0.8%，平均为0.66%，(见表3)。通过MEGA4.0软件构建NJ树(图1)，安徽省野生赤链蛇分为3个分支，皖南、皖西各一支，沿江、江淮和淮北为另一支。

表3 赤链蛇群体间D－Loop序列不同单倍型的双参数距离(对角线下)和序列差异百分比(对角线上)Table 3 Kimura 2－parameter distance(below diagonal)and percent difference(above diagonal)for different hapotypes on D－Loop sequences of Dinodon rufozonatum

3 讨论

6个赤链蛇野生种群之间的序列差异百分比在0.5%到0.8%之间，在mt DNA碱基替换中存在转换偏奇，随着进化时间的增加，颠换的积累，转换偏奇会下降;同时，一般认为转换颠换的比值小于2.0时，则此基因序列的突变已经达到饱和状态，受进化噪音的影响可能性较大。对赤链蛇野生种群的研究也说明了分歧时间越长、亲缘关系越远的分类单元之间，核苷酸发生颠换的频率越高，即亲缘关系较近的物种之间总是有更高的转换差异比例;同时，赤链蛇野生种群之间的偏奇可能会随着进化时间的增加和空间隔离的加剧而下降，而它们之间的突变因受到多重替换和饱和效应的影响而达到饱和。

一般认为，置信水平值(BCL)高于70%的分支为可信[11]。从构建的系统树上充分反映了皖南种群和皖西种群之间的遗传距离最远，而淮北、江淮和沿江种群之间距离适中。所以考虑到赤链蛇在安徽的分布现状和各地理种群的分布情况，将这6个地理种群分为3系。赤链蛇的遗传分化呈现出地理区域上的连续性。Barber等认为地理障碍与气候特征的差异在种系地理学结构的形成过程中可能起到了非常重要的作用。作者在进行安徽省的赤链蛇资源现状调查时参考陈壁辉等对安徽地理分布区的划分，采集的标本包括淮北、江淮、沿江、皖西和皖南5个地区，但江淮地区选取了蚌埠荆山和滁州皇甫山的标本，虽然同属一个地理区划，但种群之间也出现了差异。沿江江北、皖南、皖西3系的分化与山脉形成的地理隔离有关。而长江与淮河的隔离作用不大，迁徙能力较强的赤链蛇进入同一地域中可能发生一定的基因交流。同时，随着经济、交通的发展和偷猎走私的日益猖獗，使爬行动物有机会进入其他分布区，也进一步导致了各个地理种群遗传结构的变化。

[1]赵尔宓，黄美华，宗愉.中国动物志(爬行纲，第三卷)[M].北京:科学出版社，1998.

[2]国家林业局.国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生动物名录[J].野生动物，2000，21(5):49－82

[3]陈仁寿.浅析《本草纲目》蛇的药用[J].南京中医药大学学报:自然科学版，2000，16(5):309－310

[4]蔡亚非，刘兆斌，张利军，等.赤链蛇达氏腺内分泌细胞免疫细胞化学[J].解剖学杂志，2004，27(2):184－187.

[5]张蕾，李淑兰.赤链蛇(Dinodon rufozonatum)消化道嗜银细胞的分布及形态学观察[J].哈尔滨师范大学:自然科学学报，2009，25(1):77 －79.

[6]杨超，杨传秀，聂刘旺.赤链蛇不同组织Sox基因表达的RT－PCR分析[J].激光生物学报，2004，13(5):334－338.

[7]Kyle C J，Wilson C C.Mitochondrial DNA identification of game and harvested freshwater fish species[J].Forensic science international，2007，166(1):68 －76.

[8]Teletchea F.Molecular identification methods of fish species:reassessment and possible applications[J].Reviews in Fish Biology and Fisheries，2009，19:265 －293.

[9]Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al.The Clustal X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Research，1997(24):4876 －4882.

[10]Kumar S，Tamura K，Nei M.Mega 3.0:Integrated Software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and Sequence A-lignment[J].Briefings in Bioinformatics，2004(5):150 － 163.

[11]Rozas J，Sánchez del Barrio J C，Messeguer X，et al.DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods[J].Bioinformatics，2003(19):2496 －2497.