郭志华，吴刚强，李 雅*，唐 云，毛湘屏，王月爱，孙 涛

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙410007；2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙410208；3.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙410005）

心肌重构是慢性心力衰竭 （chronic heart failure，CHF）发生的基本病理机制[1]。 近年来大量研究显示，Ca2+-CaN-NFAT3信号通路在各种原因导致的病理性心肌肥大、心肌重构和心衰的发生发展过程中发挥着重要作用[2]。 中医对心衰的病机有深刻的认识，认为其总病机为本虚标实，病理基础是心气、心阳虚，标实为血瘀、水饮[3]。 基于此理论，创建益心泰颗粒。 前期研究结果显示，益心泰可改善CHF 大鼠心肌重构，提高心功能[4]。但益心泰改善CHF 心机重构的机制尚不清楚，本研究采用阿霉素耳缘静脉注射致CHF 兔模型， 从Ca2+-CaN-NFAT3信号通路入手， 深入探讨益心泰颗粒对CHF 的作用机制，为益心泰颗粒的临床推广应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 成年健康普通级新西兰兔150 只，雌雄各半，体质量1.7～2.0 kg，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2 主要药物及试剂 益心泰颗粒(由黄芪、丹参、红花、泽泻、猪苓等组成)，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供， 每克益心泰颗粒含生药3.1 g；氯沙坦钾：50 mg/片，由杭州默沙东制药有限公司生产；盐酸阿霉素：10 mg/瓶，由深圳万乐药业有限公司生产。钙（Ca）测试盒（批号：C004-2）、钙调神经磷酸酶（CaN）测试盒（批号：A068）：由南京建成生物工程研究所提供；NFAT3 抗体（批号：2183）、PNFAT3 抗体（批号：sc-68704）：由Santa cruz 公司提供。

1.1.3 实验仪器 电子天平TP-2200B （湘仪天平仪器设备有限公司）；IE33 彩色多普勒超声诊断仪（荷兰philips 公司）；MOTIC 显微图像摄影系统 （德国 麦克奥迪实业集团公司）；Nova Blot 半干法转印仪、SDS-PAGE 垂直电泳仪及ImageQuant LAS 4000 mini 凝胶成像仪（美国GE Healthcare 公司）；PCR 仪器（德国Eppendof 公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模 随机抽取20 只家兔为正常对照组，其余130 只参照文献[5]造模。 将盐酸阿霉素配制成浓度为1 mg/mL 的溶液，经耳缘静脉注射药量为1 mg/kg， 每周2 次， 连续8 周， 即累计给药量至16 mg/kg。 造模后左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率(LVFS)、E 峰与A 峰的比值（E/A）显著降低（P﹤0.01）；造模后室间隔厚度（IVS）、 左心室后壁（LVPW）、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室舒张末期内径(LVIDd) 及血清BNP 显著升高 （P﹤0.01），且家兔出现精神差、少动、纳食减少等心衰表现，说明造模成功。

1.2.2 实验分组及处理 将造模成功兔随机分为5组，模型组（21 只）、益心泰低（21 只）、中（21 只）、高剂量组（21 只）和氯沙坦钾组（20 只），加上正常对照组（20 只）。 于实验第9 周开始灌胃，正常对照组和模型组均以等容积的生理盐水灌胃， 益心泰低、中、高剂量组分别按照2.1、4.2、8.4 g/kg（分别相当于人临床用量5、10、20 倍）灌胃，氯沙坦组予氯沙坦2.73 mg/kg 灌胃。 共4 周，1 次/d， 灌胃容积为10 mL/kg。

1.3 观察指标及方法

用药4 周后，麻醉处死全部实验兔，取兔心肌组织，切成多份，100 mg/份，待测。

1.3.1 心肌细胞内钙离子[Ca2+]i 采用激光共聚焦显微镜扫描测定。 荧光探针标记： 将心肌细胞于37 ℃水浴中用Fluo3/AM 避光孵育60 min，1 750 g离心1 min，去除负载液，生理记录液洗涤3次。 应用激光共聚焦显微镜扫描形态完整及染色效果好的细胞。 心肌细胞荧光值（钙离子浓度）测定：激发波长为488 nm，发射波长为520 nm。图像经过计算机系统处理后得到细胞内分布图，经系统分析和换算后得出Ca2+荧光强度。

1.3.2 心肌组织钙调神经磷酸酶(CaN)活性 采用酶学比色法测定。 酶促反应：将对照管、测定管离心10 min，3 500 r/min，取上清液50 μL 定磷，再室温静置5 min，636 nm，0.5 cm 光径， 以蒸馏水调零，标准空白管、磷(P)标准管、组织匀浆样品管及其对照管均加入50 μL 待测溶液， 测各管吸光度OD值，计算CaN 活力。

1.3.3 心肌组织T 细胞活化因子3 （NFAT3）、p-NFAT3 表达 采用Western blot 法检测。 心肌组织冰上匀浆60 min，充分裂解后，4 ℃21 000 g 离心30 min，取上清，Bradford 法测定蛋白质，制备SDSPAGE 浓缩胶与分离胶、上样，电泳，先16 mA/gel跑15 min，然后32 mA/gel 跑至溴芬兰指示剂到达胶的底部时即停止， 然后0.8 mA/cm2， 转移1、2、3 h，分别与一抗（1∶500）、二抗（1∶2 000）温育。 显影成像，计算其与β-actin 的比值。

1.3.4 心肌组织NFAT3 mRNA 表达 采用RTPCR 法检测。提取总RNA：TRIzol 抽提总RNA，测定OD 值，检测RNA 的纯度及浓度并定量。 逆转录合成cDNA：配置逆转录反应体系(20 μL)，置于PCR仪中，42 ℃60 min，75 ℃10 min，4 ℃5 min。 引物设计与合成：β-actin： 上游5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGG -3'； 下 游 5' -AGGGGCCGGACGCGTCATACT-3'。 NFAT3： 上 游 5'-ACAGAAGAGGGGGCGTCTCAG -3'； 下 游 5' -ACCAATAGGGGCAGCACCATA-3'。 PCR 反应体系：配置逆转录反应体系(20 μL)， 置于PCR 仪中，95℃5 min，94 ℃1 min，54 ℃1 min，72 ℃1 min，重复30 次，然后72 ℃5 min，4 ℃冰箱保存。 琼脂糖凝胶电泳：扩增产物10 μL，电压120 V，1.5%琼脂糖凝胶电泳， 用Gel pro 4.0 版凝胶成像系统分析，计算NFAT3/β-actin 比值。

1.3.5 心肌组织病理结构观察 4%多聚甲醛固定心肌组织48 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明4 h、石蜡包埋、 切片厚4～5 μm、60 ℃温箱中烤片、HE 染色、光镜观察并采图。

1.4 统计学分析

采用统计软件SPSS 17.0 进行数据处理。 计量资料以“±s”表示，多样本间均数比较采用方差分析，P﹤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物死亡情况

正常组因麻醉意外死亡1 只，模型组，益心泰高、中、低组和氯沙坦钾组因腹泻分别死亡2、1、1、1、1 只。

2.2 心肌细胞内[Ca2+]i 含量及心肌组织CaN 水平

与正常对照组比较， 模型组心肌细胞内[Ca2+]i含量及心肌组织CaN 水平显著升高（P﹤0.01）。 与模型组比较，益心泰低、中、高剂量组和氯沙坦钾组心肌细胞内[Ca2+]i 含量及心肌组织CaN 水平显著降低（P﹤0.01）。 详见表1。

表1 各组心肌细胞内[Ca2+]i 含量及心肌组织CaN 水平的变化（±s）

表1 各组心肌细胞内[Ca2+]i 含量及心肌组织CaN 水平的变化（±s）

注：与正常对照组比较●●P＜0.01；与模型组比较★P＜0.05，★★P＜0.01。 下表同。

组 别正常对照组模型组益心泰低剂量组益心泰中剂量组益心泰高剂量组氯沙坦钾组n 19 19 20 20 20 19[Ca2+]i(nmol/L)75.10±5.24 161.60±10.60●●141.30±8.33★★134.67±9.63★★130.97±6.89★★131.66±6.95★★CaN(U/mg 蛋白)3.49±0.29 8.55±0.45●●7.15±0.43★★6.83±0.58★★6.55±0.41★★6.57±0.55★★

2.3 心肌组织NFAT3、p-NFAT3 及NFAT3 mRNA表达

与正常对照组比较，模型组心肌组织NFAT3、p-NFAT3及NFAT3mRNA 表达显著升高 （P﹤0.01）。与模型组比较， 益心泰低剂量组心肌组织NFAT3、NFAT3mRNA 表达降低（P﹤0.05），p-NFAT3表达显著降低（P﹤0.01），而益心泰中、高剂量组和氯沙坦钾组心肌组织NFAT3、p-NFAT3及NFAT3mRNA 表达显著降低（P﹤0.01）。 详见表2。

表2 各组心肌组织NFAT3、p-NFAT3 及NFAT3 mRNA 表达（±s）

表2 各组心肌组织NFAT3、p-NFAT3 及NFAT3 mRNA 表达（±s）

组 别正常对照组模型组益心泰低剂量组益心泰中剂量组益心泰高剂量组氯沙坦钾组n 19 19 20 20 20 19 NFAT3 0.26±0.02 0.86±0.06●●0.79±0.06★0.73±0.06★★0.69±0.05★★0.71±0.05★★p-NFAT3 0.17±0.03 0.64±0.04●●0.50±0.04★★0.47±0.05★★0.45±0.05★★0.45±0.06★★NFAT3 mRNA 0.17±0.04 0.79±0.06●●0.73±0.09★0.58±0.09★★0.55±0.08★★0.54±0.08★★

2.4 心肌组织病理结构

正常对照组心肌细胞排列正常， 无断裂和水肿，细胞间质无炎细胞浸润。 模型组心肌细胞排列紊乱，部分断裂；心肌细胞明显水肿、坏死，大量炎细胞浸润。 益心泰低剂量组心肌细胞排列紊乱，心肌细胞轻度水肿，有较多炎细胞侵润。 益心泰中剂量组心肌纤维排列基本正常， 有较多炎细胞浸润。高剂量组心肌纤维排列基本正常， 少许炎细胞浸润。 氯沙坦钾组心肌纤维排列正常，间质少量炎细胞浸润。 见第72 页彩图图1。

3 讨论

本研究采用阿霉素耳缘静脉注射致CHF 兔模型，造模后存活104 只，均符合造模成功标准，造模成功率80%（104/130）。 其他家兔因腹泻致死，可能为家兔不耐受阿霉素的毒副作用， 出现了肠炎，最后因脱水而发生休克致死亡。 与文献[6]报道阿霉素致结肠炎而造成动物造模成功率低结果吻合。

心肌重构是CHF 发展的病理生理基础，在心肌重构的发生发展过程中，钙调神经磷酸酶（CaN）往往作为起始信号传导系统，其蛋白表达水平的改变远远早于心肌重构的发生[7]。 而作为钙调神经磷酸酶的下游转录因子活化T 细胞核因子（NFATc）包括5 种成员， 其中NFAT3作为CaN 的下游蛋白，在CaN 介导的心肌重构中发挥着重要作用[8]。 Ca2+作为细胞内信号传导的信使， 与CaN 介导的信号通路密切相关。 心肌细胞浆内的Ca2+升高，激活CaN，使磷酸化的NFAT3去磷酸化并进入细胞核，诱导多种与心肌细胞增殖相关的基因表达，最终导致心肌重构，发展为心衰。

益心泰颗粒为作者经验方，方中君药黄芪既可补气，又可利水消肿；臣药丹参活血化瘀；佐药泽泻、猪苓为利水渗湿；使药红花，载药入心经。 本研究结果显示，与正常对照组比较，模型组心肌细胞内[Ca2+]i 含量、心肌组织CaN 水平、NFAT3、p-NFAT3及NFAT3mRNA 表达显著升高，且病理结构中也显示心肌细胞排列明显紊乱，细胞明显水肿、坏死，出现大量炎细胞浸润。 说明CHF 兔Ca2+-CaN-NFAT3信号通路被激活，诱导大量炎性细胞的浸润，从而导致心肌细胞水肿、坏死，排列紊乱。 与模型组比较，益心泰低剂量组心肌组织NFAT3、NFAT3mRNA 表达降低，心肌细胞内[Ca2+]i 含量及心肌组织CaN 水平、p-NFAT3显著降低，而益心泰中、高剂量组和氯沙坦钾组心肌细胞内[Ca2+]i 含量、 心肌组织CaN 水平、NFAT3、p-NFAT3及NFAT3mRNA 表达显著降低，说明益心泰能有效阻断心肌组织内该信号传导通路的激活，减少炎性细胞的浸润，减轻心肌细胞的水肿等，从而有效治疗CHF。 综上可知， 益心泰颗粒抑制慢性心力衰竭时Ca2+-CaN-NFAT3信号通路激活，可能是其治疗慢性心衰的主要机制之一。

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