文 竹，姜义仁，黄 伶，王斌赫，钟 亮，王 勇，秦 利

(沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳农业大学柞蚕研究所，辽宁省昆虫资源工程技术研究中心，沈阳 110866)

昆虫的肠道是从昆虫发育开始就一直伴随着昆虫的生长、代谢等活动而结构复杂的环境，在昆虫的肠道中寄生了大量的种类丰富的微生物，这些肠道内的微生物在昆虫营养物质的吸收、利用和分解中起着非常重要作用(相辉和黄勇平，2008;黄云等，2009)。研究发现，一些以植物枝液作为食物来源的胸喙亚目Sternorrhyncha 昆虫，与其体内的共生菌存在协作关系，体内共生菌可以消化分解植物木质部中的纤维素，使这一种类的昆虫可以在营养条件缺乏和不均衡的条件下存活，为其生命活动提供能量(Baumann，2005)。另有研究表明，昆虫肠道内共生菌可以提高宿主抵御外来天敌的作用，如Glaser 和Meola (2010)证明了黑腹果蝇Drosophila melanogaster 可以通过与体内沃尔巴克体Wolbachia的共生系统，抑制病毒传播从而提高对节肢介体病毒侵染的抵抗能力。同时这一研究结果也暗示了沃尔巴克氏体可以提高致倦库蚊Culex quinquefasciatus 抵抗RNA 病毒侵染的能力。

目前对于昆虫肠道细菌多样性研究主要来自于等翅目Isoptera，在鳞翅目Lepidoptera 和鞘翅目Coleoptera 昆虫中也进行了一些研究调查。通过对不同种类昆虫进行肠道微生物的研究发现，昆虫肠道微生物的种类组成随着昆虫种类不同而不同。但已有昆虫肠道微生物研究发现，变形菌门和厚壁菌门都是广泛存在肠道中的常驻类群(夏晓峰等，2003;Shinzato et al.，2005;Anand et al.，2010)。研究者通过生理生化分离培养法和分子生物学相结合进行不同昆虫的肠道菌群结构多样性的研究，鉴定了多个细菌种类(袁志辉等，2006;相辉等，2007)，并证明了利用肠道微生物能提高家蚕Bombyx mori 等昆虫的经济生产价值(易平发等，2001)。纤维素是白蚁主要的生物能源物质，而其体内共生细菌在消化水解木质纤维素方面起到非常重要的作用，可以将纤维素水解成乙酸为白蚁提供能量 (曾文慧等，2010;韦戈等，2014)。家蚕以桑叶为食，桑叶中主要含有果胶、木聚糖、纤维素和淀粉四种多糖，Anand 等(2010)在家蚕肠道内共分离出11 种不同菌群，其中三种分离菌可以水解纤维素和木聚糖:气单胞菌属Aeromonas sp.可以利用羧甲基纤维素钠和木聚糖;液化沙雷氏菌Serratia liquefaciens 可以利用羧甲基纤维素、木聚糖和果胶;环状芽孢杆菌Bacillus circulans 可以利用全部四种多糖。在柞蚕Antheraea pernyi的研究中，邹昌瑞等(2011)发现，芽孢杆菌属是柞蚕肠道内的产酶菌属，可产纤维素酶和蛋白酶的肠道菌均为芽孢杆菌。

细菌的核糖体RNA (rRNA)编码具有功能性和进化上的高度保守性。细菌16S 核糖体RNA(16S rRNA)的核苷酸序列分布在其周围的1500个碱基左右的区域。细菌的16S rRNA 含有九个或更多的保守“通用”序列，每个保守区之间都具有物种的特异性序列，这些区域可以为后续进行的PCR 和分子杂交以及细菌鉴定提供基础(张武先等，2011)。Giraffa 等(1998)使用核糖体DNA 扩增片段限制性内切酶分析 (amplified rDNA restriction analysis，ARDRA)方法鉴定了乳制品中含有的德氏乳杆菌Lactobacillus delbrueckii 及其三个亚种，使ARDRA 技术在实践中用于确认DNA 数据库中关于16S 序列的限制性图谱得到验证。16S rDNA PCR 扩增和ARDRA 技术被证明是用于识别菌株的一个可靠和快速的方法。由于ARDRA 是以核糖体DNA 序列的功能性和保守性为基础进行的酶切分析，因此用于鉴定不同种类的结果也相对更为可靠，可以在16S rDNA 基因水平上对不同细菌进行区分(Mario et al.，1992)。

栎黄掌舟蛾 Phalera assimilis 属鳞翅目Lepidoptera 舟蛾科Notodontidae，此虫主要寄生在柞树和榆树等经济树木上，以幼虫取食树叶为害(许青云和王卫红，2011)，以8月孵化出的第二代幼虫为害最为严重，是柞树和柞蚕的重要害虫之一，极端年份甚至可将柞叶取食殆尽，严重影响柞蚕茧产量(王传海，2009)。本研究分离鉴定栎黄掌舟蛾幼虫肠道好氧菌群，研究其肠道产酶菌能力，为研究栎黄掌舟蛾幼虫的取食特性及消化机理，发掘新的产酶菌资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 栎黄掌舟蛾

供试栎黄掌舟蛾幼虫采集自沈阳农业大学东陵柞园。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基(陈天寿，1995):牛肉粉3.6 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、琼脂15 g，加蒸馏水至1000 mL，pH7.2。

纤维素酶筛选培养基(顿宝庆等，2008;邹昌瑞，2011):

(1)筛选培养基(羧甲基纤维素钠CMC-Na 培养基):酵母浸粉1.0 g，NaCl 6 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KH2PO40.5 g，CaCl20.1 g，K2HPO42.0 g，羧甲基纤维素钠15 g，(NH4)2SO42.0 g，琼脂粉18 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0。

(2)种子培养基(纤维素酶提取培养基):蛋白胨10 g、酵母浸粉10 g、羧甲基纤维素钠10 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、CaCl21 g、FeSO41 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0。

(3)发酵培养基:蛋白胨10 g、酵母粉10 g、羧甲基纤维素钠10 g、NaCl 5 g、KH2PO41 g，蒸馏水1000 mL，pH7.0。

1.1.3 主要试剂

16S rDNA 引物购自上海生工生物工程有限公司，限制性内切酶Hae Ⅲ、Hind Ⅲ购自宝生物公司，10× M buffer 购自宝生物公司，DNS 试剂配制方法参照(唐冰等，2006)。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌的分离和纯化

选取健康的栎黄斑舟蛾3 龄幼虫饥饿处理24 h，体表喷洒酒精进行体表消毒，放入75%酒精溶液中浸泡3 min 消毒并杀死，在灭菌水中清洗3 次，然后在蜡盘中无菌解剖，取出其肠道(嗉囊到直肠)放在无菌研钵中备用。

1.2.2 肠道菌分离培养

将取出的肠道每8 头为1 组，加入1 mL 无菌水匀浆，匀浆后迅速2 倍、4 倍稀释，每个稀释度取50μL 用涂布法接种于NA 培养基上进行分离培养，每个稀释度重复2 次。倒置培养48 ±2 h，挑取表征各异的菌落再进行分离、纯化培养，分离的菌株斜面培养后在4℃下保存。

1.2.3 菌落形态及生理生化分析

从培养基分离得到菌落形态各异的肠道菌，对分离菌株进行生理生化检测。检测方法包括明胶液化、葡萄糖发酵、蔗糖利用等 (周德庆，1982;朱旭芬，2011)。

1.2.4 肠道分离细菌的16S rDNA 序列的PCR

使用菌落PCR的方法，采用细菌16S 通用引物对栎黄掌舟蛾幼虫肠道细菌的16S rDNA 序列进行扩增，正向引物 (F:5'-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3');反向引 物 (R:5'-ACGGCTA CCTTGTTACGACTT-3')。PCR 反应体系为:细菌DNA 模板 (菌悬液)2μL，正反引物各2μL，10×Buffer 5.0μL，dNTP 4.0μL，Taq 酶0.5μL，补充H2O 至总体系50μL。

PCR 反应程序(袁秀洁，2010):94℃预变性3 min;94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，34 次循环，72℃最终延伸5 min。

1.2.5 核糖体DNA 扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)

采用HaeⅢ、HindⅢ组合酶切核糖体DNA 扩增片段(孙佑赫和熊智，2012)，10μL 酶切体系(田方，2008):PCR 产物5μL，Hae Ⅲ、Hind Ⅲ各0.5μL，10×M buffer 1μL，补充水至10μL，37℃酶切4 h。

1.2.6 细菌16S rDNA 测序

挑选酶切结果不同的菌株送至上海生工生物工程有限公司进行测序，再与NCBI 数据库进行基因BLAST 比对。

1.2.7 产纤维素酶菌株筛选及酶活测定

将菌种由培养斜面接种到含有30 mL 种子培养液的150 mL的三角瓶中，37℃、180 r/min 振荡培养24 ±2 h，无菌吸取1 mL 种子液加入到50 mL发酵培养基中，200 r/min、37℃振荡培养48 ±2 h，取出后5000 r/min 离心10 min，所得上清液为粗酶液并进行酶活力测定。

采用DNS 方法，将酶液用无菌水稀释10 倍后取0.5 mL 酶液加入1.5 mL 浓度为0.625%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液中，在50℃下水浴30 min，取出后加入2 mL 浓度为10%的NaOH 溶液终止反应，再加入3 mL 配制号的DNS 试剂(于沸水中煮15 min)，测定波长为520 nm 时的OD520值(Huang and Jiang，2002;吴琳等，2009)。

取配制好的浓度为10 mg/mL的标准葡萄糖溶液5 mL，用蒸馏水定容至50 mL，使终浓度为1 mg/mL，参照邹昌瑞等(2011)配制成不同葡萄糖浓度的溶液，每个浓度取5 mL 混合液在沸水浴中煮沸5 min，用自来水流动冲洗冷却后，加入10 mL 蒸馏水，震荡混匀，在520 nm 波长处测定光密度。

将不同浓度葡萄糖溶液充分混匀后，使用紫外可见分光光度计选择波长520 nm 处比色测定，用葡萄糖浓度为0的溶液调零，分别记录光密度值。绘制出标准曲线，用于计算肠道菌株产纤维素酶的酶活力。

2 结果与分析

2.1 肠道细菌的分离及生理生化分析

栎黄掌舟蛾幼虫中肠肠道匀浆悬液经倍比稀释涂布在基础培养基培养后，根据菌落形态特征的不同分离得到23 株好氧细菌(编号1-23)，菌落颜色以白色、黄色为主，圆形或不规则圆形，多湿润、不透明(表1)。

表1 菌落形态特征Table 1 Colony morphologies

对分离的各菌株进行革兰氏染色、淀粉水解、脂肪水解、糖发酵、甲基红等检测，根据菌株的各项生理生化特性的相似性将供试菌株分成7 大类，第1 类包括1、3、4、15、17、20、21 号菌株，第2 类包括5、6、10、11、18、19 号菌株，第3 类包括13、14、16、22、23 号菌株，8 号和9号菌株完全相同，2 号、7 号、和12 号菌分别与其它菌株都有明显差别(表2)。

表2 菌株的生理生化检测结果Table 2 Physiological and biochemical tests of strains

(续上表)

2.2 细菌16S rDNA 序列PCR 扩增结果

以提取的细菌DNA为模板，采用通用引物对23 株细菌样品的16S rDNA 进行PCR 扩增，得到重复性好、稳定清晰的特异扩增片段，长度约1500 bp (图1)。

2.3 细菌16S rDNA的PCR 扩增片段ARDRA分析

供试细菌16S rDNA 经PCR 扩增后的片段采用Hae Ⅲ、Hind Ⅲ组合双酶切(图2)，根据酶切结果将供试菌株分为7 类，第1 类包括1、3、4、15、17、20、21 号菌株，第2 类包括2 和12 号菌株，第3 类包括13、14、16、22、23 号菌株，第4 类包括5、6、10 和18 号菌株;第5 类为7 号菌株，第6 类为8、9 和11 号菌株，第7 类为19号菌。

图1 栎黄掌舟蛾幼虫肠道细菌16S rDNA的PCR 产物Fig.1 16S rDNA PCR production of bacteria from larval Intestine of Phalera assimilis

图2 栎黄掌舟蛾幼虫肠道细菌16S rDNA的酶切分析Fig.2 16S rDNA digested analysis of bacteria from larval intestine of Phalera assimilis

2.4 细菌16S rDNA 序列分析

图3 16S rDNA 序列的N-J 法分析Fig.3 Bacterial 16S rDNA sequences N-J method phylogenetic analysis system

根据上述酶切结果，筛选出不同类群的1、2、5、7、8、13、19 号共7个代表菌株进行测序，对测定的7个菌株的16S rDNA 序列提交在线NCBI工具进行BLAST 序列同源比对，并利用MEGA 5.05 软件采用邻接法(N-J)构建系统发育进化树(图3)，所得序列与数据库中数据做比对分析，结果表明 1 号菌株与 Staphylococcus sciuri(KF876871.1)、Staphylococcus gallinarum (DQ350835.1)同源性为99%，属于葡萄球菌属Staphylococcus sp.;2 号菌株与Curtobacterium sp.(KJ184962.1)、Curtobacterium sp.(KJ184941.1)有99%同源性，属于短小杆菌属Curtobacterium sp.;5 号菌株与Lysinibacillus sp.(JN082733.1)、Lysinibacillus sphaericus (KF151164.1)有99%同源性，属于赖氨酸芽孢杆菌属Lysinibacillus sp.;7 号菌株与Arthrobacter creatinolyticus (JX476083.1)、Arthrobacter sp.(FJ804474.1)有98%同源性，属于阿特拉津降解菌属Arthrobacter sp.;8 号菌株与Staphylococcus sciuri (KF876871.1)、Staphylococcus gallinarum (DQ350835.1)有99%同源性，属于葡萄球菌属 Staphylococcus sp.;13 号菌株与Curtobacterium sp.(DQ205304.1)、Curtobacterium sp.(AY688361.1)有99%同源性，属于短小杆菌Curtobacterium sp.;19 号菌株与Enterococcus sp.(GU585584.1)、Enterococcus mundtii (JN995582.1)有99%同源性，属于肠球菌Enterococcus sp.;结合酶切图谱、形态特征及生理生化分析，本研究分离得到的1、3、4、8、9、11、15、17、20、21 号菌属于葡萄球菌属，2、12、13、14、16、22、23号菌属于短小杆菌属，5、6、10、18 号菌属于赖氨酸芽孢杆菌属，7 号属于阿特拉津降解菌属，19 号属于肠球菌属。表明筛选得到的以葡萄球菌属和短小杆菌属为主要的菌种类型。

2.5 产纤维素酶筛选及纤维素酶活力测定

根据不同的葡萄糖浓度的OD520绘制出标准曲线，见图4。

通过筛选培养基筛选出产纤维素酶菌株6个，主要为芽孢杆菌属和短小杆菌属。其中10 号菌株的酶活力最高，13 号菌株的酶活力最低(表3)。

图4 标准葡萄糖曲线Fig.4 The normative curved line of glucose

表3 纤维素酶活力测定(平均值±标准差)Table 3 Enzyme activity of Cellulase producing bacteria (Mean±SD)

3 结论与讨论

鳞翅目昆虫的肠道内环境pH 值为碱性(pH8-10)，使得嗜碱菌群更加适合繁殖和生存。叶丝纤维素转化率很低(10%左右)一直是困扰蚕业及其制品的生产的问题，并因此导致经济成本增加，生产效率不高。进行昆虫肠道中的菌群结构、产酶菌及酶活力研究，对开发利用昆虫微生物资源具有重要的意义 (Broderick et al.，2004;相辉等，2007)。90%甚至更多的自然微生物是无法通过人工培养分离纯化的。单一依靠培养手段鉴定细菌不能全面反映真实结果(袁志辉等，2006)。

用ARDRA 多态性分析的方法和Hae Ⅲ、Hind Ⅲ组合双酶切更加轻松便捷地对不同菌株进行类群划分，简化了传统分类鉴定方法需要检测不同生化指标的复杂步骤，节省了大量的培养时间(Vaneechoutte and Rudi，1992)。通过对23 株分离菌株进行16S rDNA 序列的PCR 扩增以及双酶切图谱可以看出，ARDRA 分析和Hae Ⅲ、Hind Ⅲ组合双酶切可以反映出分离的肠道菌株的同源多样性。

本研究在栎黄掌舟蛾肠道中所分离得到的23个好氧菌株中，包括葡萄球菌属9 株、短小杆菌属7 株、赖氨酸芽孢杆菌属4 株、肠球菌属2 株和阿特拉津降解菌属1 株，以葡萄球菌属和短小杆菌属居多。其中短小杆菌属属于变形菌门，赖氨酸芽孢杆菌属、肠球菌属、葡萄球菌属属于厚壁菌门。可见在栎黄掌舟蛾肠道内，厚壁菌门和变形菌门为优势菌群。而我们采用相同方法从取食同一柞树的柞蚕5 龄幼虫肠道中分离出芽孢杆菌属Bacillus、不动杆菌属Acinetobacter 及肠杆菌属Enterobacter，其中芽胞杆菌属是柞蚕5 龄幼虫肠道中的主要菌群(黄伶等，2014)，二者肠道微生物类群明显不同。在安徽省合肥市饲养的柞蚕肠道微生物类群则多以芽孢杆菌、葡萄球菌和肠杆菌为主(邹昌瑞等，2011)。同时，得到的阿特拉津降解菌与常规的肠道微生物类群有一定区别，常见的肠道菌群多为变形菌门和厚壁菌门，由于阿特拉津Atrazine 是一种广泛且大量使用的农业除草剂，且辽河流域的地表水水体中阿特拉津含量非常高(严登华等，2005)，推测阿特拉津降解菌属的出现可能是与此环境有关，应属于过路菌，并非是幼虫体内常驻菌群。对同为鳞翅目的另外4 种害虫棉铃虫Helicoverpa armigera、菜青虫Pieris rapae、稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis 和甜菜夜蛾Spodoptera exergual的肠道微生物研究中发现(杨焊，2012)，四种昆虫的肠道菌群结构非常相似，都含有克雷伯氏菌属Klebsiella.sp、肺炎克雷伯氏菌K.pneumoniae 和微球菌属Micrococcus sp.，四种昆虫都是以变形菌门和厚壁菌门为肠道优势菌群，但同时也都含有各自所特有的菌群。本试验从栎黄掌舟蛾幼虫肠道分离的菌群同样具有其独特的结构组成，可能由于这些害虫取食的植被不相同所造成。野生状态下昆虫所摄取的植物中会含有环境下的特定物质，会影响肠道菌群的组成，因此采集自不同地区的相同种类的昆虫也会鉴定出不同种类的肠道菌群。有研究表明昆虫取食的食物中若含有大量的丹宁，会改变一种水生昆虫幼虫的肠道内生菌结构 (Walenciak et al.，2002;相辉和黄勇平，2008)，柞树叶中含有大量的单宁，不同种类单宁含量不同 (刘延兰等，1984)，这可能是影响取食柞树昆虫的肠道微生物组成不同的因素之一。

叶丝纤维素转化率很低(10%左右)一直是存在于蚕业及其制品生产过程中的问题，树木的养殖成本又占有很大的比重，导致经济效率不高。因此对家蚕、柞蚕和与它们争食的鳞翅目昆虫的肠道产纤维素菌群的研究十分必要。

由酶活力测定可以看出，与柞蚕肠道微生物相比，栎黄掌舟蛾幼虫肠道产纤维素酶菌的酶活力不高，没有柞蚕肠道产纤维素酶菌的分解能力强(邹昌瑞，2011)。本实验室采集相同环境生存的5 龄柞蚕幼虫，筛选其肠道产纤维素酶菌株，其酶活力为85 U/mL，栎黄掌舟蛾肠道产纤维素酶菌株比柞蚕肠道中的酶活力低(本实验室研究结果待发表)，这可能与柞蚕经过长期驯化及向着高饲料效率方面选择有关。

产纤维素酶的菌株能够帮助植食性昆虫的消化和吸收，有利于昆虫的生长发育，但能否应用于经济昆虫的饲养与繁殖领域还有待于进一步研究。产纤维素酶菌不仅可以提高柞蚕等经济昆虫的经济价值，还可提供新型微生物资源，应用于食品加工、造纸、医疗卫生和环境保护等领域，因此对纤维素酶和产酶菌的深入研究及应用具有非常广阔的前景。

栎黄掌舟蛾是柞园的主要害虫，其幼虫低龄期群居性取食和高龄期的食量暴增的为害对柞树及柞蚕茧产量影响极大。本文试验结果对栎黄掌舟蛾幼虫肠道微生物的初步研究对于今后鳞翅目昆虫的取食和为害行为研究，研制新型微生物农药制剂及开发微生物资源提供了理论基础。

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