章海荣 韩 玲 王万银 刘玉龙 张 倩 家常亮

第二军医大学海医系 上海 200433

流式细胞仪在航海医学实验教学中的设计与应用

章海荣 韩 玲 王万银 刘玉龙 张 倩 家常亮

第二军医大学海医系 上海 200433

流式细胞仪作为一种先进的细胞定量分析检测仪器，广泛应用于航海医学专业教育与科研研究领域，并起到了关键作用。流式细胞仪实验课程通过流式细胞术原理讲解、仪器演示以及实验操作环节，帮助学员渐进学习和掌握相应内容。根据航海医学专业的教学需求，开设流式细胞仪实验课程，按照流式细胞仪的构造及原理讲解、细胞样本制备、细胞DNA含量和凋亡检测、操作演示等四方面进行教学。通过流式细胞仪实验课程教学的实施，学员整体加深了对流式细胞仪基础知识的理解和掌握，提升了动手操作能力、科研分析及解决问题的能力，为学员在日后的科研实验中利用该项技术奠定了良好的基础。

流式细胞仪；实验教学

流式细胞仪（flow cytofluorometers）是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科仪器，用以实现对细胞特征及细胞或细胞器的组成进行定性和定量分析。随着流式细胞术的不断发展，现已成为当前科技领域发展十分迅速的生物学技术之一，它不仅渗透到航海医学各基础学科，还广泛应用于临床治疗的各个领域。

流式细胞仪在航海医学基础研究中，主要用来测量细胞蛋白质含量测定、DNA和RNA含量分析、细胞凋亡和细胞增殖的分析、免疫细胞功能分析、细胞内活性氧检测、线粒体膜电位分析、细胞生长因子CBA分析、红细胞计数、血小板GP分析和定量流式细胞术等。

第二军医大学海医系实验教学中心（以下简称“中心”）大型精密仪器室是大型仪器操作服务和实验教学平台，流式细胞仪承担了全校本科及研究生的实验教学任务。我室流式细胞仪型号为BD FACSCalibur，在实验教学中，我们率先引入了流式细胞术，旨在实现细胞生物学，FCM理论知识与学生动手操作能力培养的有效融合，不断拓展学员科研创新等能力培养素质的培养。

1 流式细胞术原理

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种在功能上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段。FCM的结构分为三大部分，流动式及液流驱动系统（聚焦细胞以供检测）、激光光源及光速形成系统（激发和收集光信号）、信号检测、存贮、光电转换、数据处理系统（将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析）。其信息主要来自特异性荧光信号及非荧光散射信号。散射光信号包括前向角散射光（Forward Scatter，FSC）及侧向角散射光（SideScatter，SSC）。在进行荧光密度分析时，对每个细胞都进行集中不同波长条件下的测定。荧光抗体最常用于显示细胞表面特异受体的密度，从而对分化不同的细胞类型的亚群进行辨别，其中也包括对表达导入基因的细胞核表达特殊标志物细胞进行识别。

2 实验教学设计实施

中心的流式型号为BD FACSCalibur，是第一台全自动多色流式系统兼具分析和分选双向功能的台式机，其多参数系统能提供航海医学基础科研实验所必需的客观、可重复性的实验结果。实验教学中我们根据仪器使用情况及选修学员的人数，合理安排时间，采取仪器现场观摩、学生分组轮换的形式对仪器进行讲解教学。

先讲授流式细胞术的基础原理，并进行仪器构造的讲解和展示，使学员对流式细胞仪有初步的了解。进一步对液流系统、光学系统、电子控制系统、数据处理系统、细胞分选系统5部分系统及各部分工作原理进行介绍，同时阐述待测标本经过仪器的上述系统的情况，将流式细胞仪原理拓展并贯穿至各个系统中，使学员对流式细胞仪有整体清晰的把握，从而达到教学目的。

3 样本制备及仪器操作演示

操作环节的教学顺序为文件建立、标本制备、参数设定、样本采集、结果分析、数据导出。主要分三方面内容。

（1）逐一开启稳压电源、计算机、激光光源进入开机程序，强调开、关机过程及仪器日常维护的注意事项。

（2）运行Cell Quest软件，讲解软件的组成部分、流式检测常用术语介绍、荧光补偿原理及调节应用、检测结果图的表示形式。

（3）以单色和双色实验为例，利用BD公司培训用的荧光微球，现场演示DNA含量分析（PI单色）、细胞凋亡分析（Annexin V-FITC/PI双色）等分析检测方法。

通过上述教学演示，学员对流式细胞术的操作有了一定的了解，并加深了对仪器原理及构造的认识，为后续实验教学环节奠定基础。

4 实例操作分析

实验一：人体乳腺癌细胞DNA含量分析

（1）收集细胞：用不含EDTA的0.25%的胰酶消化离心。

（2）细胞固定：加入预冷的70%乙醇（PBS配制），于4 ℃固定或-20 ℃长期固定。

（3）酶解RNA：以1 mL预冷的PBS洗细胞一次，加入预冷的PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1.0×106，取出100 uL细胞悬液，加入RNase A酶，使RNase A终浓度为1 mg/mL，混匀后37 ℃水浴30 min。

（4）荧光染色：加入PI综合染色液，使PI终浓度为50 ug/mL，混匀，4 ℃冰箱避光保存。

（5）上机检测：300目尼龙网过滤后，上机检测。

实验二：小鼠成纤维细胞凋亡分析

（1）收集细胞：用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化时间不宜过长，以避免容易引起假阳性）。

（2）洗涤细胞：用PBS洗涤细胞二次（2000 rpm离心5 min）收集1～5×105细胞。

（3）悬浮细胞：加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞；（可根据细胞多少适当调整buffer的量，最少可以减少到100 uL）。

（4）荧光染色：加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide，混匀。

（5）上机检测：室温、避光、反应5 min～15 min；在1 h内，进行下述荧光显微镜或流式细胞仪的观察和检测。

5 实验结果与分析

实验一：人体乳腺癌细胞DNA含量分析

在生物细胞中，DNA含量是恒定的参量，DNA含量随着细胞增殖周期各时期不同而发生变化。DNA含量检测是流式细胞仪应用最早且目前仍然广泛应用的指标之一。恶性肿瘤细胞一般多出现异倍体，研究表明DNA含量分析对细胞毒性药物的研究很有价值。DNA含量分析可以提供细胞周期信息，通过荧光染料碘化丙啶（Propidium ，简称PI）是一种双链DNA的荧光染料，PI与DNA分子可特异性结合，且具有一定正比量效关系比。在细胞DNA直方图上，原则上其异倍体G0/1期细胞DI值（DNA index）之差0.2以上时，或DI值之差虽然不大于0.2，但出现两个明显的细胞峰，均视为不同克隆细胞。一般DI值之差＜0.2时，视为同一克隆细胞。如检测结果表明是DNA异质性肿瘤，这表明它是多克隆起源的，则肿瘤恶性程度更高（如图1所示）。

图1 乳腺癌细胞周期检测的正常组和增值组变化

实验二：小鼠成纤维细胞凋亡分析

细胞凋亡（apoptosis，Apo），又称细胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD），是指细胞在一定的胜利或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、基因控制的、一系列酶参与的过程。在形态学上，细胞凋亡改变了他们的光散特性。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35～36 kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide， PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开。图2为该小鼠成纤维细胞凋亡检测的正常组和增值组变化情况。

图2 小鼠成纤维细胞凋亡分析

6 结束语

该实验教学实现了教学和科研的有机结合，通过FCM相关内容的理解和掌握，学员的海航医学基础实验操作技能有了一定的提高。在细胞标本的制备到上机检测、结果分析等一系列步骤中，不仅学生动手操作能力、科研分析及解决问题的能力得到了培养和锻炼，学生的积极性也得到充分的调动。通过师生之间的互动，优化了实验教学方案，提高了教学质量，取得了较好的教学成果。在提高流式细胞仪利用率的同时，也最大限度地发挥了现有仪器设平台的资源优势和师资特长，使学员接受了最好的专业训练。目前选修流式细胞仪实验课程的本科生和研究生人数逐年增长，我们将进一步优化我们的平台，使得越来越多的学员得到更好的学习和锻炼。

［1］杜立颖，张丽君.流式细胞术新实验的开发［J］.实验技术与管理，2004，21（6）：17-20.

［2］张俊峰，刘道亮，赵占民.流式细胞术在微生物快速检测领域的研究进展［J］.食品工程，2010（3）：19-22.

［3］贾永蕊.流式细胞术在DNA检测中的应用［J］.中国医学装备，2010，7（4）：4-6.

［4］王书奎，周振英.实用流式细胞术彩色图谱［M］.上海：第二军医大学出版社，2004.

［5］刘爱平.细胞生物学荧光技术原理和应用［M］.合肥：中国科技大学出版社，2007.

［6］汪道鑫，虞春华，叶颖俊.T淋巴细胞的研究进展［J］.第四军医大学学报，2009，30（24）：3193-3195.

［7］彭萍，陈林，杨丽华.流式细胞术在免疫学中的应用研究［J］.现代诊断与治疗，2012，23（12）：2159-2160.

［8］熊见，解小红，王长本.流式细胞术检测网织红细胞的多参数分析及方法评价［J］.检测医学与临床，2010，7（13）：1295-1296，1298.

［9］Richard R.Jahan-Tigh，Caitriona Ryan， Gelinde Obermoser，et al.Flow Cytometry［J］.Journal of Investigative Dermatology，2012，132：282.

［10］B e n d a l l S C，N o l a n G P， R o e d e r e r M， e t a l.A deep profiler’s guide to cytometry［J］.Trends Immunol，2012（33）：323-32.

［11］史晓红.塞来昔布促进顺铂诱导人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的实验研究［D］.重庆：重庆医科大学，2008-04-01.

Design and Implementation of Flow Cytometry Experiments Teaching in Pharmacy

Zhang Hairong， Han Ling， Wang Wanyin， Liu Yulong， Zhang Qian， Jia Changliang
Second Military Medical University， Shanghai， 200433， China

Flow cytometry as a quantitative analysis of the most advanced cell testing equipment， is widely used in pharmacy professional education and scientifc research in the feld， and played a key role. Flow cytometry experiments to explain the principles of fow cytometry course， equipment demonstrations and experiments operating areas， to help students learn and master progressive. According to the characteristics of the teaching hospital pharmacy professional learning， the creation of fow cytometry experiments curriculum， and designed a flow cytometer operation demonstration， explain the structure of the instrument， sample preparation， cell DNA content and apoptosis detection four teaching content. In the process of implementing the teaching of flow cytometry experiments， we found that participants overall deepened the understanding of the basics of flow cytometry and master， to enhance the hands-on ability， scientific analysis and problem-solving skills for students in future research real experimental use of the technology has laid a good foundation.

fow cytometry； experimental teaching

2014-06-09

章海荣，本科，实验师。通讯作者：韩玲，教授，主任。